Biológia | Tanulmányok, esszék » Kovács Mihály - Egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése

Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése Doktori (Ph. D) értekezés Kovács Mihály Témavezető: Dr. Nyitray László Külső témavezetők: Prof. Clive R Bagshaw, Dr Málnási-Csizmadia András ELTE TTK Biológia Doktori Iskola Szerkezeti Biokémia Doktori Program Programvezető: Prof. Gráf László Budapest, 2002. Összefoglalás Munkánk kiindulópontjául azok az alapvető problémák szolgáltak, amelyek a miozin működésének vizsgálatában az egymásnak ellentmondó szerkezeti és kinetikai eredmények kapcsán tisztázatlanul maradtak. Nem volt ismert például, hogy az ATP-áz ciklust energetikailag „előrehajtó” nukleotid-kötési folyamat során milyen állapotváltozásokon keresztül történik a szabadenergia akkumulációja. Az ATP-hidrolízissel egyidejűleg detektált nagy konformációváltozás és a katalitikus lépés közötti összefüggés szintén felderítetlenül maradt E konformációs

átmenetnek, amely valószínűleg a miozin „erőkarjának” kilengésével jár együtt, a sebességmeghatározó foszfát-felszabadulási folyamatban betöltött szerepe is tisztázatlan. E kérdések megválaszolására olyan egy-triptofános miozin motorokat terveztünk és állítottunk elő, amelyek fluoreszcencia-változásai specifikusan követik a fehérjemolekulának az enzimműködés során bekövetkező állapotváltozásait. Az ATP-kötőhelyen érzékeny szenzort tartalmazó, a kötési lépések szelektív detektálását lehetővé tevő konstrukciók segítségével azonosítottuk és jellemeztük a ligandum-indukált állapotváltozásokat, és kimutattuk, hogy a szabadenergia akkumulációja több lépésben történik az enzim és a nukleotid indukált illeszkedése során. Az ATP-hidrolízist megelőző további nagy konformáció-változásra egy, a nukleotid kötőhelytől távolabb elhelyezkedő triptofán érzékeny. E szenzort felhasználva

tranziens kinetikai vizsgálatokkal közvetlenül bizonyítottuk, hogy a konformációs átmenet és az ATP-hidrolízis különálló lépések, és kinetikailag jellemeztük azok csatoltságát. Modellünkben a gyors konformációs átmenet – amely aktinhoz kötött állapotban az erőkifejtő lépés lehet – többször megtörténik, mielőtt az aktív helyen a hidrolízis lejátszódna. További vizsgálatainkban a konformációs egyensúlyt a miozin fej két szubdoménjének kölcsönhatási felszínébe épített pontmutációkkal szelektíven tudtuk befolyásolni, és kimutattuk, hogy ily módon az ATPhidrolízis sebessége a két lépés kapcsoltsága folytán „finomhangolható”. Eredményeink a miozin működési ciklusáról nyújtott dinamikus kép mellett utat nyitnak olyan további szenzorok tervezésének és konstrukciójának, amelyekkel a konformáció-változások kinetikáján keresztül a fehérjemolekulán belüli kölcsönhatások dinamikus mivoltukban

vizsgálhatók. Ezek fontosságát az adja, hogy az enzimműködésről és az energiaátalakításról kizárólag a szerkezeti, kinetikai-termodinamikai, valamint molekuláris mechanikai modellek közelítésével, szintézisével kaphatunk valódi képet. Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése Summary In this study, we addressed several fundamental problems regarding the myosin enzymatic mechanism that were still unresolved because of the conflicting findings obtained in structural and kinetic experiments. First, changes in the enzyme during the nucleotide binding process accompanied by free energy accumulation still had to be unravelled. A large conformational change concomitant with ATP hydrolysis was detected, but it was not known how this conformational transition is coupled to the chemical step. It was also unclear whether this change, which appears to be accompanied by the movement of the lever arm of the myosin

molecule, plays a role in the rate-limiting phosphate release process. To answer these questions, we designed and produced single tryptophan motors whose fluorescence changes can be used to specifically monitor the transitions occurring in the protein molecule during the enzymatic cycle. By using constructs containing sensors in the ATP binding site that allow for selective detection of the nucleotide binding steps, we identified and characterised the ligand-induced structural changes. We showed that free energy is accumulated during multiple steps of the induced fit. A tryptophan sensor located further away from the nucleotide binding pocket can be used to monitor another large conformational change preceding ATP hydrolysis. We carried out transient kinetic experiments on a construct containing this sensor to provide direct evidence that the conformational transition and ATP hydrolysis are distinct events. Our model based on kinetic analysis of the coupling between these steps shows

that the fast conformational change, which can constitute the working stroke when bound to actin, takes place several times before hydrolysis occurs. Furthermore, we were able to selectively perturb the conformational equilibrium by point mutations introduced into the interface between two subdomains of the myosin head. We demostrated that this perturbation allows ‘fine tuning’ of the ATP-hydrolysis rate via the coupling between the two steps. Besides the dynamic picture obtained about the myosin enzymatic cycle, these results provide a basis for the design and construction of other sensors that allow assessment of the dynamics of interactions within the protein molecule through kinetic characterisation of conformational changes. The significance of this approach is that understanding of enzyme action and energy transduction can be achieved only by converging the views and models based on structural, kinetic-thermodynamic and molecular mechanical investigations. 5 Doktori

értekezés Tartalomjegyzék 1 2 1.1 1.2 1.3 2.1 Bevezetés 9 Miért fontosak és érdekesek a molekuláris motorok? 9 Mire voltunk kíváncsiak? 9 A használt terminológiáról és jelölésekről 10 Irodalmi áttekintés 12 2.2 Energiaátalakítás az aktomiozin rendszerben – a „machina carnis” működésének klasszikus modelljei 12 Mit mondanak a szerkezetek? 14 2.3 Az aktomiozin működés kinetikája 22 2.4 Az ismert szerkezetek kapcsolata a kinetikai állapotokkal – kérdőjelek az erőgenerálás mechanizmusa körül 25 2.21 A miozin alegység- és doménszerkezete 14 2.22 Proteolitikus és rekombináns miozin fragmentumok 15 2.23 A fej három ismert konformációja 16 2.231 Motor domén szerkezetek és a nyitott-zárt konformáció-változás 17 2.232 Többféle konformáció egyazon nukleotiddal az aktívelyen 18 2.233 Affinitás a távozó foszfáthoz 18 2.234 A harmadik ismert konformáció 19 2.235 Kommunikáció az aktin és nukleotid-kötőhelyek,

illetve az erőkar között a motor szubdoménjei közötti „kapcsok” révén 19 2.24 Az aktin és az aktomiozin komplex szerkezete 20 2.31 A miozin ATP-áz ciklus 22 2.311 A nukleotid-kötés és -disszociáció legalább kétlépéses folyamatok 22 2.312 A termékfelszabadulás a sebesség-meghatározó lépés 23 2.313 Az ATP-hidrolízis lépés az enzimen reverzibilis 23 2.32 Aktin-aktiváció, erős és gyenge aktinkötő állapotok 24 3 4 3.1 3.2 3.3 3.4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.51 4.52 4.53 4.6 4.7 4.8 4.81 4.82 6 Célkitűzések 28 Triptofán szenzorok azonosítása és dinamikája 28 A nukleotid-kötési lépések felbontása 28 A nyitott-zárt átmenet és az ATP-hidrolízis kapcsolata 28 Az ATP-hidrolízis sebességének beállítása 28 Anyagok és módszerek 29 A kísérleti megközelítésről 29 DNS konstrukciók elkészítése 29 Expressziós rendszer, fehérjepreparálás 30 Steady-state ATP-áz aktivitás mérése 31 Steady-state fluoreszcencia-mérések

32 Steady-state anizotrópia-mérések 34 Kvantumhatásfok-mérések 34 Kioltási kísérletek 35 Időfelbontott fluoreszcencia-mérések 35 Megállított áramlásos mérések 36 Relaxációs kinetikai kísérletek 37 Hőugrás 37 Nyomásugrás 38 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése 4.9 5 5.1 5.2 Adatok feldolgozása és kiértékelése 39 Eredmények és megbeszélésük 40 Miért éppen a motor domén? 40 Triptofán szenzorok a motor doménben – fluoreszcencia-változások, molekuláris dinamika és a jelek eredete 42 5.21 Intrinsic próbák a miozin fejben 42 5.22 A relé-hurok triptofán: egy „természetes” riporter 42 5.23 Triptofán szenzorok a nukleotid kötőzsebben 44 5.231 A nukleotid kötőhelynél elhelyezkedő triptofánok fluoreszcencia-változásai 45 5.24 Változások alap- és gerjesztett állapotban, kvantumhatásfokban, oldószerkitettségben 46 5.25 Életidő-komponensek és a triptofánok

dinamikája 47 5.26 Steady-state és időfelbontott anizotrópia 49 5.27 A spektrális változások értelmezése a szerkezeti adatok fényében 50 5.271 A kötéskor bekövetkező fluoreszcencia-változások eredete 50 5.272 Konformációs „szubállapotok” a szenzorok környezetében 51 5.273 A relé-hurok „felolvadása” – statikus vagy dinamikus rendezetlenség? 53 5.3 5.31 5.32 5.33 5.34 5.35 5.4 5.41 5.42 A nukleotid-kötési folyamat érzékeny kinetikai felbontása a kötőzseb melletti triptofánt tartalmazó mutánsok segítségével 55 Háttér 55 A ligandum-kötési lépések tranziens kinetikai vizsgálata 56 A kötési modell megerősítése más nukleotidokkal és szenzorokkal 61 A kötőzseb-triptofán valóban csak a kötési lépésekre érzékeny 62 A kötési lépések és az aktomiozin disszociáció kapcsolata 63 A nyitott-zárt konformációs átmenet és az ATP-hidrolízis lépés kinetikai szétválasztása és kapcsoltságának vizsgálata 65

Előzetes megfontolások 65 A nyitott-zárt egyensúly hőmérsékletfüggésének vizsgálata a W501+ fluoreszcencia segítségével 67 5.421 apo, ADP és ADPAlF4: három különböző globális konformáció 67 5.422 A hőmérséklet hatása a steady-state ATP-áz köztiállapotok összetételére 68 5.423 AMPPNP és ADPBeFx: két globális konformáció hőmérsékletfüggő egyensúlyban 68 5.424 A nyitott-zárt egyensúly termodinamikai paraméterei: egymást kompenzáló nagy entalpikus és entrópikus tagok 69 5.43 A gyors kezdeti csökkenés kimutatása alacsony hőmérsékleten megállított áramlásos méréssel 70 5.44 A konformációs átmenet kimutatása hőugrással 71 5.45 Nyomásugrásos méréssel a nyitott-zárt átmenet és a hidrolízis közvetlenül detektálhatók 72 5.46 A két csatolt lépés dinamikus modellje 74 5.5 5.51 5.52 5.53 5.54 5.55 6 Az ATP-hidrolízis sebességének „finomhangolása” szubdomének közötti kölcsönhatások

megváltoztatásával 77 Szerkezeti háttér – szubdomén-mozgások a miozin fejben 77 Irányított mutációk az N-terminális és konverter szubdomének kölcsönhatási felszínén 78 Steady-state fluoreszcencia: konformációs állapotok részaránya ATP-ben, AMP.PNP-ben, ADPBeFx-ban 79 A nyitott-zárt egyensúly és az ATP-hidrolízis sebesség megváltozása 81 A mutációk hatása a foszfát felszabadulására 84 Konklúziók 87 7 Doktori értekezés 7 8 8 Perspektíva 90 8.1 Köszönetnyilvánítás 92 Acknowledgements 93 9 Rövidítések jegyzéke 94 10 Ábrák és táblázatok jegyzéke 95 11 Az értekezés alapjául szolgáló publikációk 97 12 Irodalomjegyzék 98 13 Táblázatok 103 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése 1 Bevezetés „If my body functions as a pure mechanism, yet I am sure that I am determining its motions, then I must be the person who controls the motion of the atoms in

accordance with the laws of nature. I must therefore be God.” Erwin Schrödinger: What Is Life? (1944) 1.1 Miért fontosak és érdekesek a molekuláris motorok? A molekuláris motorok az enzimek azon csoportját alkotják, amelyek egy exergonikus kémiai reakcióhoz (amely leggyakrabban ATP, illetve egyéb nukleotidok hidrolízise) mechanikai funkciót, munkavégzést kapcsolnak. Ennek alapján a közelmúltban javasolták ezen fehérje-csoportnak az enzimek egy új, VII. osztályába (“energázok”) való sorolását is (1) A molekuláris motorok közé tartoznak többek között a lineáris mozgatást végző eukarióta citoszkeletális fehérjék (tubulinkinezin, tubulin-dinein illetve aktomiozin rendszer), a baktériumok forgómozgást végző flagelláris motorjai, a mitokondriális ATP-szintáz – az oxidatív foszforiláció kulcsenzime –, valamint a nukleinsav “síneken” mozgó DNS- és RNS-polimerázok, illetve a nukleinsavakat kémiailag módosító egyes

enzimek is. Ahogy nincs anyag mozgás nélkül, úgy működőképes élő sejt sem képzelhető el motorfehérjék hiányában. Az aktomiozin rendszer például olyan alapvető sejtfolyamatokban játszik fontos szerepet, mint a sejtalak és -polaritás meghatározása, a kario- és citokinézis, az exoés endocitózis, a különböző sejtnyúlványok (lamellipódiumok, filopódiumok) létrehozása és mozgatása, az irányított sejtmozgás (lokomóció) illetve a kemotaxis. A molekuláris motorok kutatásának jelentősége a terület interdiszciplináris szemléletet követelő alaptudományos (sejtbiológiai, biokémiai, enzimológiai, biofizikai, mechanikai) érdekességén túl az alkalmazás irányába egyrészt az e fehérjékkel kapcsolatos – főleg öröklött – betegségek kialakulási mechanizmusának, illetve diagnosztikai és terápiás lehetőségeinek feltárása, másrészt a nanotechnológiában történő felhasználásuk révén mutat. 1.2 Mire voltunk

kíváncsiak? Az aktomiozin rendszer központi eleme a miozin ún. motor doménje, amelynek funkcionális részei – az aktin illetve a nukleotid kötőhelye, valamint a molekula „erőkarja” – közötti kommunikáció vizsgálata képezi a motor működés megértésének kulcspontját. Munkánk során a szerkezeti kép kézzelfoghatóságát a kinetikai megközelítés dinamizmusával igyekeztünk párosítani, külön-külön megcélozva az ATP-áz ciklus lépéseit a nukleotid kötésétől az ATP9 Doktori értekezés hidrolízisen keresztül egészen a termékek felszabadulásáig – mindvégig szem előtt tartva az egyes folyamatok jelentőségét az aktinnal történő „együttműködés” szempontjából. Miozin motor domén konstrukciók előállításával és vizsgálatával a fehérje különböző ligandum-kötött állapotai, az ATP-áz intermedierek, valamint a molekula globális és lokális konformációs átmenetei közti összefüggéseket

vizsgáltuk. Kísérleteinkben génsebészeti, fehérjeexpressziós, biokémiai, spektroszkópiai, valamint steady-state és gyorskinetikai technikák alkalmazásával a következő kérdésekre kerestünk választ: (a) Milyen állapotokon keresztül, hány lépésben történik az ATP irreverzibilis kötése során a nagy szabadenergia-csökkenés? A kérdés fontosságát az adja, hogy a miozin fej nukleotidkötése során végbemenő változások energetikailag a ciklus kulcslépései, mivel a ligandum kötése szolgáltatja az aktomiozin komplex disszociációjához szükséges szabadenergiát. (b) A miozin fej ATP-hidrolízissel egyidejűleg detektált nagy konformáció-változása és a katalitikus lépés kinetikailag szétválaszthatók-e és ha igen, mennyiben kapcsoltak egymáshoz? A konformációs átmenet az erőkifejtő lépéssel áll szoros összefüggésben, ezért e kapcsoltság döntő fontosságú az erőgenerálás mechanizmusában. (c) A fenti konformációs

egyensúly hogyan befolyásolható a miozin szubdoménjei közötti kölcsönhatási felszín változtatásával, illetve megváltoztatása milyen hatással van az ATPhidrolízis, valamint a foszfát-felszabadulás sebességére? A dolgozatban ismertetett kísérletekkel a miozin motor domén különböző időskálákon zajló molekuláris mozgásait követtük nyomon. Triptofán szenzorok fluoreszcencia-jelének analízise révén információt nyerhettünk az enzimmolekula dinamikájáról, az egyedi oldalláncok rotációjától (10–9-10–8 s időskála) a fluorofór környezetében történő kisebb átrendeződéseken (10–7-10–5 s) keresztül a fehérje globális konformációs átmeneteiig (10–4-102 s) terjedő széles tartományban. E változásoknak a rendelkezésre álló szerkezeti ismeretek birtokában végzett kinetikai elemzésével alkottunk dinamikus modellt a miozin ATP-áz működéséről. 1.3 A használt terminológiáról és jelölésekről A dolgozatban

igyekeztem minden lehetséges helyen magyar szakkifejezéseket használni az angolszász terminusok helyett – néhány olyan esetben is, ahol az adott fogalomra csak szórványosan használt magyar megnevezés létezik, vagy még ilyet sem sikerült találnom. A félreérthetőséget elkerülendő ilyenkor megemlítem az angol változatot is. A „steady-state” kifejezést nem fordítottam le, mivel ez sok helyütt szokatlan vagy értelemzavaró lett volna. Gyakorlati okokból a „reverzibilis” és „irreverzibilis” kifejezéseket azok szigorúan vett termodinamikai tartalmától kissé eltérő módon használtam: irreverzibilisnek az olyan folyamatot neveztem, amelynek 10 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése egyensúlyi állandója olyannyira eltér az egységnyitől, hogy az egyik irányban végbemenő változás az elemzés szempontjából elhanyagolható. Szintén az egyszerűség kedvéért

„hőérzékenynek” és „nyomásérzékenynek” akkor jelöltem meg egy folyamatot, ha esetében a hőmérséklet- illetve nyomásfüggés a vizsgált hőmérsékleti tartományban az elemzés szempontjából jelentős volt. Nem teljesen egységes az irodalomban az „intermedier” (intermediate) kifejezés tartalma sem. A dolgozatban „intermediernek” illetve „köztiállapotnak” neveztem egy reakció-útvonalon a kiindulási anyagok és a termékek között szereplő valamennyi, kísérletileg közvetlenül vagy közvetetten kimutatható állapotot. A miozin fej nukleotid-mentes konformációját (aktin távollétében) apo állapotként említem, megkülönböztetve azt az aktomiozin komplex szintén nukleotid távollétében előállítható rigor állapotától, mivel utóbbiban a miozin fej konformációja a rendelkezésre álló adatok alapján vélhetőleg eltér az apomiozinétól. Az egyes kinetikai lépések sebességi állandóit (i-edik lépés esetén)

k+i-vel jelöltem a leírás szerint „jobbra”, k–i-vel „balra” tartó irányban; Ki az asszociációs, Kdi a disszociációs állandót jelöli. A különböző fluoreszcencia-intenzitású állapotok jelölésekor a * a kiindulási állapothoz képest magasabb, míg a † szimbólum alacsonyabb fluoreszcenciájú állapotra utal. Pontmutáns konstrukcióink elnevezésénél eltértünk a szokásos nevezéktantól, amely minden egyes megváltoztatott pozíciónál megnevezi a vad típusú fehérjében, illetve a mutánsban található aminosavat is. Mivel a konstrukciók többsége viszonylag sok mutációt tartalmazott, a rövid nevekben csak a fehérjében meghagyott vagy újonnan bevitt triptofán pozícióját neveztük meg a + jel előtt (pl. W501+) A konstrukciókban található valamennyi pontmutáció felsorolását a 2. táblázat tartalmazza 11 Doktori értekezés 2 Irodalmi áttekintés A miozin a számos sejtműködésben alapvető szerepet játszó

molekuláris motorok vizsgálatának legfontosabb kísérleti objektuma. A motor működési mechanizmusával kapcsolatban a nagy mennyiségű rendelkezésre álló adat ellenére számos kérdés még tisztázásra vár, mivel az elektronmikroszkópos és kristályszerkezetek révén az elmúlt néhány évben kialakult kép és az immáron közel három évtizede felállított kinetikai séma közötti összefüggés több ponton nem egyértelmű. Jelen összefoglalóban a téma igen terjedelmes irodalmának elsősorban a kísérleti rész problémafelvetésével és értelmezésével kapcsolatos háttér-információkat tartalmazó részét tekintem át. 2.1 Energiaátalakítás az aktomiozin rendszerben – a „machina carnis” működésének klasszikus modelljei A „spiritus animalis”, azaz az élőlényeket mozgató erő mibenléte már évezredekkel ezelőtt is foglalkoztatta a gondolkodókat. Eraszisztratosz (alexandriai iskola, i e 3 sz) már utal arra, hogy ez az erő

az izmokban rejtőzik. A rá következő hosszú időszak során többek között Galenus, Leonardo da Vinci, Vesalius és Descartes művei között találjuk meg a tőle eredeztethető pneumaelmélet különböző válfajainak kifejtését, amely szerint a pneumá-t az idegek szállítják az izmokba, ahol az duzzadást okozva fejti ki hatását (2). Az elmélet cáfolatát Swammerdam felfedezése jelentette, miszerint az izom térfogata állandó marad az összehúzódás során. Az izom kémiai energiát mechanikai munkává alakító gépezetként való termodinamikai leírását végül von Helmholtz adta meg a 19. században Az izom fehérjekomponenseinek leírásában Kühne vizsgálatai (3) jelentették az első áttörést, a mai fogalmaink szerinti miozin azonosítása azonban Szent-Györgyi Albert szegedi kutatócsoportjához, az aktin izolálása pedig Straub F. Brúnó nevéhez fűződik (4) Az ATP-ről, amelyet Lohmann egy évtizeddel korábban fedezett fel (5),

Engelhardt és Ljubimova mutatták ki, hogy az a miozin szubsztrátja és az izom „üzemanyaga” (6). Szent-Györgyi Albert csoportjához fűződik annak felfedezése is, hogy az ATP emellett az aktomiozin disszociációját idézi elő, amit a kemomechanikai ciklus modelljeinek megjelenéséig nehezen megmagyarázható jelenségként tartottak számon. A váz- és szívizom polarizált fénymikroszkópos struktúrájában szembeötlő harántcsíkolt szerkezet az ún. vékony, illetve vastag filamentumok periodikus, részben átfedő elhelyezkedéséből adódik. A vastag filamentumokról lelógó „kereszthidak” ciklikusan lépnek kölcsönhatásba a vékony filamentumokkal, és az összehúzódás a két filamentum egymáshoz képest való 12 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése elcsúszásából adódik („csúszó filamentum” elmélet, sliding filament theory). A vékony filamentumok fő alkotóeleme az aktin,

míg a miozin molekulák a vastag filamentumokat, illetve az azokból kiinduló ún. kereszthidakat alkotják A kereszthíd, amely magába foglalja a miozin molekula feji részét, tartalmazza az aktin és ATP kötőhelyeket (7-9). Az ATP-áz ciklus lépései az aktin és a miozin kölcsönhatásához kapcsoltak. Az izomkontrakció „kilendülő kereszthíd” (swinging cross-bridge) modelljét H. E Huxley (10), A F Huxley (11) és R. M Simmons (12) alkották meg, amelynek alapja a miozin fej orientációjának megváltozása a ciklus során az aktinhoz képest. A kemomechanikai ciklus első átfogó kinetikai modelljét Lymn és Taylor (13) közölték az 1970-es évek elején. A „négyütemű” modellben a miozin fej ATP-kötése az aktin filamentumról való leválással1 (detachment) jár együtt (1. ábra). Az ATP-hidrolízis során a miozin fej „felhúzott” állapotba kerül, és így kötődik vissza a vékony filamentumhoz. Az erőkifejtő lépés (munkaütem, power 1.

ábra: A Lymn-Taylor modell A négylépéses modell az erőgenerálást a miozin fejben az ATP-hidrolízis és termékfelszabadulás során végbemenő szerkezeti változásoknak az aktin-kölcsönhatáshoz való kapcsoltsága révén értelmezi. stroke) során az aktinhoz kötött miozin fej a felhúzott állapotból a lecsapott konformációba tér vissza, ezzel elhúzva a vékony filamentumot a vastag filamentumhoz képest. Ez a lépés a hidrolízistermékek felszabadulásához kapcsolt A Lymn-Taylor modell ezek alapján a „kilendülő kereszthíd” teóriára (10) épül. Terhelte azonban az elméletet az a tény, hogy a kereszthíd mozgását csak nehezen lehetett kimutatni (14, 15). Ennek oka sokáig tisztázatlan maradt Később fény derült arra, hogy a miozin fejnek csak viszonylag kis része végez jelentős elmozdulást az aktinhoz képest (lásd 2.23 fejezet) A fejnek ez az elfordulást végző, az aktinhoz képest disztális része a miozin „erőkarjának”

tekinthető. A „kilendülő erőkar” (swinging lever arm) elmélet szerint az aktin és a miozin közötti kölcsönhatási felületnek nem szükséges megváltoznia a munkaütem során. A két fehérjekomponens mindegyike egymáshoz közel elhelyezkedő, rögzített filamentumok formájában van jelen, ezért a kölcsönhatásaikat meghatározó körülmények eltérnek a szabad fehérjék oldataitól. Emiatt szokás az aktin, illetve a vastag filamentumokról “lelógó” miozin fejek szétválását disszociáció helyett leválásnak nevezni. A disszociáció kifejezést általában csak különálló, filamentumot nem alkotó miozin fejek esetén használják. 1 13 Doktori értekezés Az, hogy a miozin fejnek csak az erőkarja mozog, önmagában nem ad egyértelmű magyarázatot a „kilendülés” kimutatásának nehézségére. A fejeknek egy időben csak kis része kötődik az aktinhoz, és az erőkarmozgásnak az ATP-hidrolízishez, illetve

termékfelszabaduláshoz való közvetlen kapcsoltsága nem volt kimutatható. A jelen dolgozatban ismertetett kinetikai kísérleteinkkel e kérdéskört is vizsgáltuk, és az 5.46 fejezetben új megvilágításba helyezem a problémát. 2.2 Mit mondanak a szerkezetek? Az aktomiozin rendszer vizsgálatának első és sokáig egyetlen színtere és „fehérjeforrása” a magasabbrendű állati szervezetek egy specializált szövettípusa, az izomszövet volt. Csak jóval később derült fény arra, hogy egy általános előfordulású, minden eukarióta sejtben esszenciális szerepet játszó ősi mozgatórendszerről van szó. A szerteágazó funkciók betöltésére a miozinoknak igen sokféle, alegység- és doménszerkezetében, kinetikai és mechanikai sajátságaiban különböző csoportja alakult ki (jelenleg 18 miozin osztályt különböztetnek meg), míg az aktin monomerekre és filamentumokra nagyfokú szekvenciabeli és térszerkezeti konzervativitás jellemző. 2.21

A miozin alegység- és doménszerkezete A miozin több alegységből álló fehérje, amely „fej” és „rúd” részekre osztható (2. ábra) A fej a katalitikusan aktív motor doménből, illetve az erőátvitelben, valamint egyes izoformáknál a szabályozásban szerepet 2. ábra: A konvencionális miozinok doménszerkezete A két azonos nehézlánc feji (motor domén + nyak “erőkar”) és farok régiókat alkot, míg a két pár könnyűlánc a molekula nyaki részéhez kötődik. játszó regulációs doménből („nyaki rész”) tevődik össze. A különböző miozin osztályokban a motor domén felépítése és szekvenciája viszonylag konzervatív. E domén legvariábilisabb részletei a proteolitikusan érzékeny felszíni hurokszekvenciák A nyak a nehézlánc egy hosszú α-helikális szegmenséből és az ennek ún IQmotívumaihoz kötődő könnyűláncokból áll A nyak hossza és a kötött könnyűláncok száma illetve milyensége jelentős

változékonyságot mutat az egyes izoformák között. A konvencionális miozinok (miozin II osztály: ebbe a csoportba tartoznak pl. a váz-, szív- és simaizom miozinok, illetve az általunk kísérleti objektumként használt Dictyostelium miozin II) nyaki régiójához 14 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése nehézlánconként két könnyűlánc kapcsolódik. A motor doménhez képest proximálisan az ún esszenciális (ELC), míg disztálisan a regulációs (RLC) könnyűlánc helyezkedik el. A farok-szekvenciák illetve a farki részhez kapcsolódó, effektor funkciójú egyéb domének igen nagy változatosságot mutatnak az egyes miozin osztályok között. A konvencionális miozin nehézláncának farki része szuperhelikális (coiled-coil) szerkezetet képezve nehézlánc-dimereket hoz létre. 2.22 Proteolitikus és rekombináns miozin fragmentumok A konvencionális miozin farki része fiziológiás

ionerősségnél filamentumokat képez, ami megnehezíti az oldatbeli vizsgálatokat. Az ilyen vizsgálatokhoz ezért legtöbbször szolubilis proteolitikus illetve rekombináns fragmentumait használják. A miozin tripszines vagy kimotripszines emésztéssel nehéz (HMM: ez a szolubilis, “kétfejű” fragmentum a fejeket és a farokrégió egy proximális darabját tartalmazza) és könnyű (LMM: a farok fennmaradó része) meromiozinokra hasítható. A HMM kimotripszinnel vagy papainnal tovább hasítható az ún szubfragmentum-1-re és -2-re (S1 és S2). Az S1 (miozin “fej” (8, 9)) tartalmazza a globuláris, kizárólag a nehézlánc alkotta motor domént és a nehézlánc hosszú α-hélixéből, valamint a két könnyűláncból összetevődő “regulációs domént” (nyak). Az S1 önmagában is aktin-aktivált ATPáz aktivitást és in vitro motilitást mutat Az S1 proteolitikusan tovább hasítható N-terminális 25 kDa, középső 50 kDa és C-terminális 20 kDa

fragmentumokra (16, 17), amelyeket először funkcionális doméneknek gondoltak. Később kiderült, hogy a hasítóhelyek inkább csak a nagyobb flexibilis hurkok helyét jelölik ki a motor doménben; a nukleotid, illetve aktin kötőhelyek kialakításához több szubdomén2 is hozzájárul (2.23 fejezet) A miozin szerkezet-funkció vizsgálatában az utóbbi évtizedben egyre jelentősebb szerep jutott a rekombináns fragmentumoknak. A heterológ fehérjeexpresszió szempontjából a miozin sajnos igen „nehéz” objektumnak bizonyult. Prokarióta rendszerben – a motor domén korrekt feltekeredéséhez esszenciális megfelelő eukarióta dajkafehérjék hiánya miatt – nem állítható elő működőképes miozin fej, bár egyéb, a nyaki illetve farki részt tartalmazó fragmentumokat sikeresen termeltettek E. coli-ban (18, 19) A szerkezeti és kinetikai vizsgálatokban kulcsszerepet játszó gerinces (nyúl illetve csirke) vázizom miozint, illetve a reguláció

mechanizmusának vizsgálatában fontos fésűkagyló (Argopecten irradians) miozint eleddig egyetlen heterológ rendszerben sem sikerült hatékonyan expresszálni. Széles körben „befutott” sikeres rendszer csak 2 A közel 800 aminosavból álló, bonyolult szerkezetű motor “domén” valójában négy kompakt doménből tevődik össze, amelyeket többnyire a motor “szubdoménjeiként” említenek az irodalomban, ezért e dolgozatban is ezt a nevezéktant használtam. 15 Doktori értekezés kettő említhető: egy gerinces simaizom miozin izoformát (csirke begyből származót) a bakulovírus-Sf9 rovarsejt rendszerben sikerült előállítani (20, 21), míg a Dictyostelium discoideum sejtes nyálkagomba „saját” miozinjának illetve miozin fragmentumainak rekombináns módon történő hatékony kifejezésére alkalmas rendszernek bizonyult (22-28). A simaizom miozin motor domén fragmentumok mellett a röntgen-szerkezetvizsgálatban az ún. MDE konstrukció

játszott fontos szerepet, amely a motor doménből és rövidített (egyetlen IQ-motívumot tartalmazó) nyakból, illetve ehhez fuzionáltatott esszenciális könnyűláncból áll (21). A Dictyostelium motor domén konstrukciók a teljes miozinhoz hasonló enzimatikus sajátságokkal rendelkeznek, erőkarjuk viszont hiányzik. Ehhez a doménhez mesterséges erőkart képező más fehérjedomének (α-aktinin (28, 29), fluoreszcens fehérjék (30)) fuzionáltathatók. A rekombináns Dictyostelium S1 fragmentumok szintén fontos objektumai a szerkezet-funkció vizsgálatoknak (31). 2.23 A fej három ismert konformációja A miozin fej nukleotid nélküli, nukleotid kötőhely illetve különböző nukleotidokkal és nukleotidanalógokkal komplexet alkotó kristályszerkezetei ismertek (21, amelyek 29, 32-41), globális aktin kötőhely erőkar 3. ábra: A csirke vázizom S1 szerkezete A szerkezet megoldói szerint “Moby Dick”, illetve “ebihal” alakú fragmentum

N-terminális motor doménből és C-terminális nyaki részből (“erőkar”) áll, amelyhez a könnyűláncok kötődnek. zöld: N-terminális 25 kDa szubdomén, piros: felső (az ábrán az aktin-árok “felett” látható) és alsó 50 kDa szubdomén, kék: 20 kDa (konverter + nyak) szubdomén, sárga: ELC, lila: RLC, sárga gömb: SO42- ion a nukleotid kötőhelyen alapján konformációjuk három sorolhatók csoportba (lásd táblázatban, az 1. amelyben a diverz nevezéktan összefoglalása is található). Az első kristályszerkezet miozin a csirke vázizom S1-é volt ((32), 3. ábra). A fehérjét nukleotid-mentes körülmények között kristályosították, kötőhelye azonban nem „üres”: egy szulfátiont tartalmaz a β-foszfát kötőhelyén. A molekula lizil oldalláncait metilálni kellett a kristályosíthatóság érdekében. Ezt a szerkezetet a kötött nukleotid hiánya miatt rigor-szerű (near-rigor) struktúraként említik. A szerkezet

képet adott a feltételezett aktin kötőhely, a nukleotid zseb és a disztális nyaki rész térbeli elhelyezkedéséről, és a köztük lévő kommunikációs útvonalak 16 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése feltérképezéséhez is kiindulópontot nyújtott. A motor domén szerkezet részleteire a következő fejezetekben térünk rá. 2.231 Motor domén szerkezetek és a nyitott-zárt konformáció-változás A vázizom szerkezetet a Dictyostelium miozin II motor domén kristályszerkezetének meghatározása követte, számos különböző ligandummal a nukleotid kötőhelyen. A Dictyostelium szerkezetek két csoportba sorolhatók, amelyeket a nukleotid-kötőhelyet képező egyik hurok (switch-II)3 pozíciója alapján neveztek el. A szerkezetek egyik csoportjában (nukleotid-mentes, ADP, ATP, ADP.BeFx, AMPPNP, ATPγS, nem-nukleotid analógok, PPi) mind a szubdomének helyzete, mind a switch-II pozíciója a csirke

vázizom szerkezetben látottakhoz hasonló (29, 34-37, 40, 41). Ezt a konformációt, amely megfelel a rigor-szerű állapotnak, a switch-II pozíciója alapján nyitott szerkezetnek nevezik. A szerkezetek egy másik csoportjában a switch-II a vázizom szerkezethez képest 0,5 nm-rel a γfoszfát felé mozdul, és hidrogénhíd jön létre a Gly457 (vázizom miozinban Gly466) peptidgerincamidcsoportja és a γ-foszfát egyik oxigénje között (33, 35). Ennek a kölcsönhatásnak fontos szerepet tulajdonítanak a hidrolízis katalízisében. Ezt a szerkezetet, amelyet ADPPi analógokkal (ADP.AlF4, ADPVi)4 kaptak meg, ezért „átmeneti állapot”-nak (transition state), illetve a switch-II pozíciója alapján zárt konformációnak nevezik. A szerkezeti modell alapján csak zárt állapotban történhet meg az ATP hidrolízise. A switch-II huroknak a nyitott és zárt konformációk közötti elmozdulása a miozinhoz hasonlóan megtörténik a Ras p21-ben és más G-fehérjékben,

valamint az F1 ATP-ázban is. A Gly547 amid és a γ-foszfát közötti hidrogénhíd-kapcsolat a miozinhoz hasonlóan a G-fehérjékben és a kinezinekben is csak a zárt konformációban jön létre (43), míg az F1 ATP-áz esetében hiányzik (44). A nyitott-zárt átalakulásban szintén fontos szerepet játszó elem az Arg236 és Glu468 (vázizom) aminosav-oldalláncok között csak zárt konformációban létrejövő sóhíd-interakció, amelynek funkciója a feltételezett támadó víz stabilizálása és polarizálása lehet (45). Az elnevezés a G-fehérjék hasonló szerkezeti egységétől ered. A miozin és a kinezin nukleotid kötőhelyében elhelyezkedő hurkok nagyfokú szekvenciális és térszerkezeti hasonlóságot mutatnak a Gfehérjékhez (42). 4 Az AMP.PNP-t, amely egyetlen O-N atomcserét tartalmaz a β- és a γ-P között, illetve az ADPBeF x komplexet ATP-analógoknak tekintik a β–γ-P illetve a β-P–Be távolságnak az ATP-hez való hasonlósága okán.

(A BeFx komplex pontos sztöchiometriája nem ismert) Az ADPAlF4 és ADPVi komplexeket – nem teljesen egységes az irodalom e tekintetben sem – az „átmeneti állapot” vagy a hidrolízis utáni (ADP.Pi) állapot analógjainak tekintik, mivel itt jóval nagyobb a β-P–Al illetve β-P–V távolság, mint a megfelelő távolságok az előző esetekben, illetve a komplexek bipiramidális koordinációs geometriája (átmeneti állapot?) miatt. 3 17 Doktori értekezés A switch-II konformáció-változása együtt jár az 50 kDa fragmetumot ketté osztó, az aktin kötőhelytől kiinduló hosszú hasíték (lásd a 3. ábrán) részleges bezáródásával, valamint a Cterminális konverter szubdomén, és így – a vázizom S1 koordináták felhasználásával végzett modellezés alapján – a nyak „felhúzott” (primed, up) pozícióba való kerülésével is. (A konverter és a nyak pozíciója alapján a rigor-szerű szerkezetet „lecsapott” (down) szerkezetnek

nevezik az irodalomban.) A nyak lecsapódása az S1 disztális végénél akár 10 nm-es elmozdulást is okozhat E látványos elmozdulás az egyik alapköve az erőgenerálás „kilendülő erőkar” elméletének, amely szerint a ciklus erőkifejtő lépése az aktinhoz kötött miozin fej zárt-nyitott konformációs átalakulása. A „kilendülő erőkar” elmélet ezek alapján fehérjeszerkezeti alapot szolgáltat a Lymn és Taylorféle sémához. 2.232 Többféle konformáció egyazon nukleotiddal az aktívelyen ADP.BeFx jelenlétében érdekes módon zárt konformációban is sikerült kristályosítani a Dictyostelium motor domént ((46), a szerkezet még nem került publikálásra), ami ellentmond Smith és Rayment eredeti feltételezésének, miszerint a zárt struktúra csak a hidrolízis-reakció pentakovalens intermedierével és annak szerkezeti analógjaival (ADP.AlF4, ADPVi) jön létre (33) Igaz, a zárt ADP.BeFx kristályszerkezet egy, az előzőeknél 5

aminosavval rövidebb konstrukcióról készült, így lehet, hogy a fehérje csonkolása okozta a konformáció megváltozását. Ezt a feltételezést cáfolják a simaizom MDE konstrukció (2.22 fejezet) kristályszerkezetei ADPBeFx illetve ADP.AlF4-kötött állapotban (21), ugyanis mindkét szerkezet zárt Ez a konformáció tehát mind „normál”, mind pentakovalens ATP-analógok jelenlétében létrejöhet. A zárt simaizom szerkezetek különleges jelentőségét az adja, hogy az erőkar pozíciója felhúzott állapotban itt vált először láthatóvá. 2.233 Affinitás a távozó foszfáthoz A zárt konformációra – vélhetőleg mind a hidrolízis előtt, mind utána – a γ-foszfát oxigénjeinek szoros koordinációja jellemző. A miozin az ún „hátsó ajtó” (back door) mechanizmussal működő enzimek közé tartozik, amelyek esetén a termékek valamelyike más útvonalon válik le a fehérjemolekuláról, mint amelyen odakötődött. A foszfátnak a miozin

„hátsó ajtaján” történő eltávozásához a zárt állapotban azt blokkoló switch-II huroknak ki kell nyílnia. A zárt konformációjú motor doménnek a γ-foszfáttal létrejövő kiterjedt kölcsönhatásai miatt ADP.Pi állapotban valószínűleg a zárt állapot lényegesen kedvezőbb a nyitott-nál, ezért lesz sebesség-meghatározó a miozin ATP-áz ciklusban a foszfát felszabadulása (2.3 fejezet) Az aktin vélhetőleg switch-II nyitott állapotának kedvezőbbé tételén keresztül gyorsítja a foszfát eltávozását. 18 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése Ezeknek a lépéseknek a szerkezeti és kinetikai alapjai felderítetlenek, és az e dolgozatban bemutatott mutánsokon végzett kísérleteinkkel erre a problémára is választ kerestünk (5.55 fejezet). 2.234 A harmadik ismert konformáció Mindezidáig a fésűkagyló miozin S1 az egyetlen izoforma, amelyről 3 különböző konformáció

kristályszerkezetét sikerült megoldani (38). A nukleotid távollétében kapott szerkezet a vázizom miozin nyitott állapotához hasonló, míg ADP.Vi-tal komplexben a zárt Dictyostelium illetve simaizom szerkezeteknek megfelelő konformációt kaptak. A harmadik struktúra azonban, amelyben ADP található a nukleotid kötőhelyen, jelentősen különbözik valamennyi eddig ismert szerkezettől (39). Ebben a szerkezetben a konverter régió proximális részén, az erőkarnak a fejben található feltételezett csuklópontjánál található ún. SH1 hélix felolvadt állapotban van, ami a konverter és az erőkar nagy flexibilitását okozza. Az erőkar pozíciója is eltér mind a felhúzott, mind a lecsapott állapotoktól. A szerzők ezt a szerkezetet az enzimatikus ciklusban elfoglalt helye szerint a rigor-szerű és átmeneti állapotok közötti, stabil, aktinról levált (detached) ATP állapotként interpretálják. A kristályszerkezeti összehasonlításokból adódó

fontos következtetés, hogy az erőkar mozgásaihoz szükséges flexibilis elem valószínűleg a konverter régió és az erőkar között található, így utóbbinak a pozícióját nem kizárólag a konverter határozza meg, hanem a motor más szerkezeti elemei is befolyásolhatják. Ez lehet az oka annak, hogy míg az egyes konformációkban a különböző miozin izoformák a motor szubdomének pozíciójának konzervatitivását mutatják, addig az erőkar helyzete igen változékony. Az, hogy a „levált” szerkezetet az egyébként minden előző esetben nyitott konformációt indukáló ADP-vel komplexben sikerült detektálni, újabb példáját adja annak a jelenségnek, hogy ugyanazon ligandum jelenlétében a miozin fej többféle konformációs állapotot foglalhat el. 2.235 Kommunikáció az aktin és nukleotid-kötőhelyek, illetve az erőkar között a motor szubdoménjei közötti „kapcsok” révén Az ismert szerkezetek alapján a viszonylag nagy és

bonyolult felépítésű miozin motor domént a legcélravezetőbb négy, viszonylag rigid egységként mozgó szubdomén együtteseként felfogni. A szubdomének nevezéktana az S1 proteolitikus fragmentumain alapszik. Így megkülönböztetjük szekvenciális sorrendben a 25kDa (Dictyostelium motor doménben 1-206. aminosavak5), felső (207- A továbbiakban, ha külön nem említjük, az aminosav-pozíciók a Dictyostelium miozin II S1-re vonatkoznak. 5 19 Doktori értekezés 477) és alsó 50 kDa (478-614), valamint konverter (615-761) szubdoméneket. Ezeket az egységeket flexibilis „kapcsok” kötik össze: a már említett switch-II hurok a felső és alsó 50 kDa, az ún. relé az alsó 50 kDa és a konverter, az SH1 hélix pedig a 25 kDa és konverter szubdoméneket közötti kölcsönhatási felszínen található (4. ábra) A motor valamennyi funkcionális régiója több szubdomén részleteiből tevődik össze. A nukleotid kötőhely kialakításában a 25 kDa

és felső 50 kDa szubdomének vesznek részt6. Az aktin kötőhelyet a felső és alsó 50kDa szubdomének részletei alkotják a motor doménen végighúzódó hosszú hasíték két oldalán. Az aktin kötőhely a switch-II-n keresztül áll kapcsolatban a γ-foszfát zsebbel, 4. ábra: A szubdomének, az azokat összekötő „kapcsok” és a kötőhelyek elhelyezkedése a motor doménben amint azt a régió mutagenezise révén is sikerült alátámasztani (47). Az erőkar bázisát a konverter képezi, amely a szubdomének közül a „legmozgékonyabb”, és kiterjedt kölcsönhatási felszíne van a 25 kDa és alsó 50 kDa szubdoménekkel. A nukleotid kötőhely és az erőkar közötti kommunikáció révén a switch-II 0,5 nm-nyi elmozdulása az erőkar végén 10 nm-nyire amplifikálódik. 2.24 Az aktin és az aktomiozin komplex szerkezete Az aktin kristályszerkezetének meghatározása csak néhány évvel előzte meg a miozinét. A Gaktin monomereket7 DN-áz I-gyel,

gelszolin szegmens 1-gyel, illetve profilinnel komplexben sikerült kristályosítani (48-50). Az aktin molekula 2 doménből tevődik össze, amelyek mindegyikéhez egy-egy ún. szubdomén kapcsolódik Utóbbiak közül az egyik a szomszédos aktin monomerek közötti kölcsönhatási felszínhez járul hozzá, a másik a nukleotid kötőzseb egy részét képezi. A G-aktin atomi modelljének az orientált F-aktin gélek röntgendiffrakciós képébe történő illesztése nyomán (51, 52) készítették el az aktin filamentum szerkezeti modelljét. A filamentumban periódusonként 13 monomer 6 balmenetes fordulatban követi egymást A switch-II-n (454-459), konszenzus szekvenciája DIXGFE) kívül még másik két, konzervatív szekvenciájú hurok hozza létre a meghatározó kölcsönhatásokat a kötött nukleotiddal: ezek az ún. P-hurok (179-186, GESGAGKT) és a switch-I (233-240, NXNSSRFG). A γ-foszfát koordinálásában a már említett Gly457 (switch-II) mellett a kötött,

az ATP-vel komplexet alkotó Mg2+ ionnak, valamint a Lys185 és Ser181 (P-hurok) oldalláncoknak van fontos szerepe. 6 20 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése (emelkedés: 2,75 nm/alegység). Az F-aktin spirál ugyanakkor leírható 2 meredek jobbmenetes hélix együtteseként is, amelyekben a szomszédos monomerek 5,5 nm-enként követik egymást. A szomszédos aktin-monomerek közötti, a hélix tengelyére merőleges kölcsönhatási felület igen nagy (>30 nm2), ami esszenciális a kontrakció során fellépő nagy (akár 1000 pN-nyi) húzóerő miatt. A poláris aktin filamentumok dinamikus polimerizációja illetve depolimerizációja (treadmilling) során alacsony ATP-áz aktivitás mérhető. A kötött nukleotidnak egyébiránt inkább strukturális szerepe van, mivel F-aktinban a két szubdomén egymás felé fordul, bezárva a nukleotidot a kötőzsebbe. Az akto-S1 komplex atomi modelljét a

rendelkezésre álló kristályszerkezeteknek az ún. S1gyel dekorált aktin filamentumok elektronmikroszkópos felvételeibe való illesztésével alkották meg ((53), 5. ábra) A modell szerint a felhúzott állapotban lévő miozin fej erőkarja 45o-os szöget zár be az aktin filamentum tengelyével, amely szög az erőkifejtő lépés, vagyis az erőkar elfordulása után 90o-ra változik, így 10 nm-es elmozdulást eredményezve a nyak végénél. Az erőkar ilyen 5. ábra: Az akto-S1 komplex rekonstruált szerkezete az erőkifejtő lépés előtt és után A felső ábrán az S1 felhúzott állapotban kapcsolódik az aktin filamentumhoz, miközben nyaka kb. 45o-os szöget zár be annak tengelyével. Alul a lecsapott állapot látható, amelyben a nyak közel merőleges az aktin filamentumra. A két állapot között az erőkar disztális vége kb. 10 nm-nyi elmozduláson megy keresztül. Ebben az atomi modellben az eredeti “kilendülő kereszthíd” modellhez képest

eltérő a két fehérjekomponens orientációja, mivel ott a 90o-os szög tartozott a felhúzott, míg a 45o-os a lecsapott állapothoz (vö. 1 ábra) elmozdulását azonban az eddigi elektronmikroszkópos vizsgálatokban (53-59) nem sikerült detektálni, aminek kinetikai okára az e dolgozatban ismertetett kísérletek világítanak rá (5.46 fejezet). Egyes miozin izoformákon kimutatták a nyak jelentős elfordulását ADP-nek a rigor komplexhez való hozzáadásakor, ez azonban nem azonos a feltételezett munkaütemmel. A következőkben az aktomiozin működés kinetikai vonatkozásait tekintjük át, majd a 2.4 fejezetben rátérünk az ismert szerkezeteknek az ATP-áz ciklus köztiállapotaival való kapcsolatára. 7 A szabad aktin monomereket G-aktinnak, a filamentumokat F-aktinnak nevezik. 21 Doktori értekezés 2.3 Az aktomiozin működés kinetikája 2.31 A miozin ATP-áz ciklus A miozin ATP-áz kinetikai vizsgálatához az egyik leghasznosabb

szignált a fehérjemolekula triptofán fluoreszcenciája nyújtja (60-65). Az első átfogó modellt Bagshaw és Trentham közölték az 1970-es évek elején8 ((61, 66) 1. séma) A modell szerint az ATP-kötés kétlépéses, egy másodrendű ütközési lépésből és az azt követő nagy szabadenergia-csökkenéssel járó izomerizációból álló folyamat. Ez utóbbi lépéshez kapcsolódik a vázizom miozinban az ATP-vel történő kölcsönhatás során bekövetkező kétfázisú fluoreszcencia-emelkedés első fázisa (M*.ATP) A reverzibilis hidrolízis-lépést (3 lépés, K3 = 10) további fluoreszcencia-emelkedés kíséri (M*.ADPPi) A ciklus sebesség-meghatározó lépése a foszfát felszabadulása (4-5 lépés) Az ADP disszociációja az ATP-kötéshez hasonlóan két lépésben megy végbe. ATP M + ADP 71 M.ATP M.ADP 6 2 M*.ATP+ Pi M*.ADP 35 M*.ADP Pii ábra: A W501+ k M*.ADPP24 M0: statikusan kio 1. séma Az M*.ADP intermedier alacsony hőmérsékleten volt

kimutatható, ahol az ADP-disszociáció sebességi állandója (21oC-on 1.4 s–1, 5oC-on 007 s–1) már megközelíti a sebesség-meghatározó lépését (21oC-on 0.055 s–1, 5oC-on 0036 s–1) A kötési, illetve disszociációs izomerizációs lépés (k– 6 ) hőmérsékletfüggése tehát erősebb, mint a sebesség-meghatározó lépésé (66). Utóbbi esetében valószínűleg konformáció-változásról van szó, mivel a lépés elsőrendű. 2.311 A nukleotid-kötés és -disszociáció legalább kétlépéses folyamatok A nyúl vázizom miozin S1-en végzett megállított áramlásos9 (stopped-flow) triptofán fluoreszcencia vizsgálatok tanúsága szerint az ATP-kötés és ADP-disszociáció legalább két lépésből álló folyamatok. A kötéskor jelentkező fluoreszcencia-emelkedés 400 s–1 körül platót Az ATP-áz ciklus lépéseinek számozásához a dolgozatban mindvégig az itt szereplő séma szolgál kiindulási alapként. 9 A gyorskinetikai

mérőmódszerek rövid ismertetését a 4.7 és 48 fejezetek tartalmazzák 8 22 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése mutatott ATP-ben és ADP-ben is (k+2 illetve k–6, 1. séma, (61)), ami arra utal, hogy a diffúziólimitált, másodrendű ütközési lépést (collision step) egy szubsztrát által indukált, nagy szabadenergiacsökkenéssel járó izomerizáció követi, amely magas nukleotid-koncentrációknál limitálja a fluoreszcencia-változás sebességét. A fluoreszcencia-emelkedés, amelynek maximális sebességi állandója a változás kis amplitúdója miatt csak bizonytalanul volt megadható, ez utóbbi lépéshez köthető. 2.312 A termékfelszabadulás a sebesség-meghatározó lépés Az ATP-hidrolízisnek a steady-state állapot kialakulása előtti sebessége (függetlenül attól, hogy a szubsztrát illetve a termékek fehérjéhez kötötten vagy szabadon vannak-e jelen) quench-flow kísérlettel

vizsgálható. A kísérlet során a reakciót miozin S1 és ATP gyors összekeverésével indítják, majd különböző időpontokban állítják meg sav hozzáadásával. A reakció első szakaszában a steady-state ATP-áz sebességhez képest gyors ATP-hidrolízis (ún. burst fázis) tapasztalható (66). A burst amplitúdója megközelíti az S1-koncentráció értékét; jelenléte azt mutatja, hogy az ATP-kötés és -hidrolízis gyorsan megtörténik (alacsony ATP-koncentrációnál a kötés (106 M–1s–1), magas ATP-koncentrációnál a hidrolízis (100 s–1) adja a kezdeti burst megfigyelt sebességi állandóját), így a termékek felszabadulása a sebesség-meghatározó lépés (0,1 s–1), amplitúdójából pedig a hidrolízis-lépés egyensúlyi állandója számítható ki (67). Mivel a foszfátfelszabadulás az „üveg nyaka” a folyamatban, az ATP-áz reakció steady-state szakaszában az M*.ADPPi intermedier van jelen legnagyobb mennyiségben 2.313 Az

ATP-hidrolízis lépés az enzimen reverzibilis Az ATP-hidrolízis teljes folyamatának egyensúlyi állandója fiziológiás körülmények között igen magas érték (Keq = [ADP][Pi]/[ATP] = 106 M), és ezt a miozin, mint enzim, nem változtatja meg. A ciklus egyes részlépései azonban lehetnek reverzibilisek Ha az S1 és izotóp-jelölt ATP 1:1 mólarányú összekeverésével indított (single turnover) reakciót olyan időpontban állították le, amikor a hidrolízis-lépés már egyensúlyba került az enzimen, a termékfelszabadulás azonban még nem indult el, az enzim-kötött nukleotidok aránya [ADP]/[ATP] = Khidrolízis-lépés = 9-nek adódott (66). (A quench-flow kísérletben a kezdeti burst fázis amplitúdója is hasonló értékre utalt.) Az ekkor feleslegben hozzáadott nem-jelölt ATP nem változtatja meg a jelölt ATP elbomlási sebességét, ami arra utal, hogy ha a nukleotid már kötődött az enzimhez, akkor csak a hidrolízist követően szabadulhat fel.

Az izotóp-kicserélési kísérletek is a hidrolízis reverzibilitását igazolják, ugyanis a H218O-ben végzett ATP-áz reakció során a felszabaduló foszfátba egynél több 18O atom épülhet be (68). 23 Doktori értekezés Szintén erre mutat az a tény, hogy a miozinhoz nagy mennyiségben adva ADP-t és foszfátot, kimutatható mennyiségű ATP keletkezik (69). A teljes ATP-áz reakció irreverzibilitása ezek alapján a ciklus más lépéseiből (nukleotid-kötés) adódik. 2.32 Aktin-aktiváció, erős és gyenge aktinkötő állapotok Az F-aktin filamentumok aktiválják a miozin ATP-áz aktivitását. (A nyúl vázizom miozin S1 bazális (aktin távollétében mért) ATP-áz aktivitása 0,1 s–1 körüli érték, amely aktin jelenlétében maximálisan 20 s–1-re emelkedik.) Az aktiváció proteolitikus fragmentumok (S1, HMM) esetében nagyobb mértékű, mint miozin filamentumoknál, aminek oka az lehet, hogy a két filamentum optimális orientációban való

találkozásának csekély az esélye, míg a szolubilis fragmentumok szabadon diffundálhatnak az aktinon lévő kötőfelszínhez. Az aktomiozin kölcsönhatás erőssége, és így az aktin-aktiváció mértéke is igen erősen függ az ionerősségtől. Az ATP kötése az aktomiozin komplex gyors disszociációját okozza. A nukleotid-kötéssel együtt járó nagy szabadenergia-csökkenés az aktomiozin fehérjekomplex egyébiránt önmagában igen erősen endergonikus disszociációjához szükséges, így energetikailag ez a ciklus kulcslépése. (A szubsztrát-indukált konformáció-változás ATP esetén < –24 kJ/mol, ADP esetén –14 kJ/mol szabadenergia-változással jár [21oC, pH 8, (61)].) Az ATP-hidrolízis sebessége aktin jelenlétében sem változik meg. A hidrolízis megtörténte után az aktívhelyén a hidrolízis-termékeket tartalmazó miozin fej visszakötődik az aktin filamentumhoz, amely felgyorsítja a foszfát- majd ADPfelszabadulási lépéseket. A

ciklus során a miozin fej erős (Kd<<1 µM: nukleotid-mentes illetve ADP-kötött állapotok) és gyenge (Kd>10 µM): ATP, ADP.Pi állapotok) aktinkötött állapotai váltakoznak egymással, így a folyamat a 2. sémán sötétítetten megjelölt útvonal mentén halad k1 A.M + ATP k2 A.MATP ka M + ATP A.MADPPi kb k4 k3 kc k5 M.ATP A.M + ADP + Pi ka k6 M.ADPPi M + ADP + Pi 2. séma 24 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése 2.4 Az ismert szerkezetek kapcsolata a kinetikai állapotokkal – kérdőjelek az erőgenerálás mechanizmusa körül Az erőgenerálás „kilendülő erőkar” elmélete alapján a miozin fej aktív helyén (a switch-II hurokban) történő kis szerkezeti változások egy erőátvivő gépezet (konverter) segítségével a miozin fej erőkarjának jóval nagyobb léptékű elfordulását okozzák, amely aktinhoz kötött állapotban az erőkifejtő lépés. A miozin fej

„felhúzása” ezek alapján a nyitott-zárt átmenetnek, míg az erőkifejtő lépés a zárt konformációban megtörtént hidrolízist követő zárt-nyitott konformációváltozásnak felel meg (46). A teória elsősorban az ismert kristályszerkezetekre és azokra az elektronmikroszkópos felvételekre épül, amelyek a miozin nyak elfordulását mutatják ADP hozzáadására. Az elmélet megerősítését adják azok az in vitro motilitási kísérletek, amelyekben a szilárd felszínhez rögzített miozin molekulák aktin-mozgatási sebessége arányos az erőkar hosszával (70, 71) – jóllehet ezek a kísérletek csak az erőkarnak az erőgenerálásban illetve a mozgásban betöltött szerepét demonstrálják, arra azonban nem adnak választ, hogy az erőkarlengés megegyezik-e az erőkifejtő lépéssel (77). Sutoh és mti (30) motor domén-fluoreszcens fehérje kimérák segítségével a motor domén C-terminális régiójának a nyitott-zárt

konformáció-változással egyidejű mozgását detektálták. Kísérleteik az aktívhely és az erőkar közötti kapcsoltságot mutatják, az erőkifejtő lépés mibenlétére vonatkozólag azonban szintén nem nyújtanak információt. Yanagida és mti. egyedi molekulákon végzett kísérleteik alapján a „kilendülő erőkar” elmélet helyett egy olyan mechanizmust javasolnak, amelyben a miozin a hőmozgást mintegy egyenirányító „racsniként” (Brownian ratchet) működik, és így egy ATP-molekula hidrolízisével több lépést is képes megtenni az aktin filamentumon (78). A miozin V molekula nyaki részének hosszát megváltoztatva kísérleteikben azt kapták, hogy az nem befolyásolta az aktinon megtett lépések méretét (79). Az aktomiozin rigor komplex és a két fehérjekomponens közötti kölcsönhatási felszín szerkezete nem ismert. Az ismert miozin kristályszerkezetek mindegyike gyenge aktinkötő állapotokat képvisel, és ahhoz, hogy az erős

kölcsönhatási felszín kialakulhasson, a motor domén konformációjának valószínűleg jelentős változáson kell keresztülmennie. A nyitott konformáció vélhetőleg az erős nukleotid-kötés létrejötte utáni, ám a hidrolízis katalízisére még nem képes M*.ATP, illetve M*.ADP állapotokkal feleltethető meg, illetve a közvetlenül nem kimutatott M*.ADPPi állapotnak, amelyből a foszfát a hidrolízis után felszabadul. Mivel ATP-analógokkal (AMPPNP, ADPBeFx) indukálható, Gulick és Rayment 25 Doktori értekezés (72) szerint ez egy gyenge aktinkötő állapot, amely ezért különbözik az erőkifejtő lépést követő (postpowersroke) állapottól. A zárt szerkezet mind ATP, mind ADP.Pi analógokkal indukálható, és a hidrolízis katalízisére képes. Ez az állapot vélhetően megfelel a Bagshaw-Trentham modellben szereplő M*.ADPPi állapotnak. Ha a hidrolízist nyitott konformációban a miozin nem katalizálja, akkor a 3 lépés

szétválasztandó a konformációs átmenetre és a katalitikus lépésre, és léteznie kell az M*.ATP intermediernek is, amely szintén zárt konformációjú (a problémával jelen munka keretei között foglalkoztunk, lásd az 5.41 fejezetben) Az erőkarmozgással járó nyitott-zárt átmenet dinamikája és az ATP-hidrolízis közötti kapcsoltság központi kérdése az erőgenerálásnak, amelyre eredményeink kapcsán kitérek az 5.46 fejezetben Annak, hogy a zárt szerkezet lenne az erőkifejtő lépés kiindulópontja (prepowerstroke állapot), ellentmond az, hogy ebben a konformációban a miozin aktin-affinitása alacsony (Kd > 10 µM). A kristályszerkezetileg azonosított konformációk közül a „levált” (detached) struktúrának az ATP-áz ciklusban elfoglalt helye a legbizonytalanabb. Ez a szerkezet azt mutatja, hogy a nukleotid kötése a miozin fejhez az SH1 hélix felolvadását és a szubdomének igen laza kapcsolatát eredményezheti. A szerkezet

mindenesetre magyarázattal szolgálhat egyrészt az SH1 és SH2 tiolok keresztköthetőségére nukleotid-kötött állapotban ((73, 74); a két oldallánc távolsága közel 2 nm az SH1 hélix megléte esetén), másrészt az SH1-hez kapcsolt spektroszkópiai próbák ATP kötésekor megfigyelhető nagyfokú mobilitására (75, 76). Ezt a konformációt a szerzők az aktinról levált ATP-kötött állapotként értelmezik (39) annak ellenére, hogy ADP található a nukleotid kötőhelyen, és az SH1 régió mobilitása az oldatban végzett kísérletekben ADP-ben is magas volt. Az aktomiozin ciklus kinetikai modellje jóval több állapotot tartalmaz, mint ahányat szerkezetileg azonosítottak. Az erős aktinkötő állapotok mellett továbbra is ismeretlen az apomiozin szerkezete Fontos kérdés, hogy ez utóbbi konformáció mennyiben különbözik a nukleotid távollétében kristályosított, nyitott konformációjú csirke vázizom és fésűkagyló miozin szerkezetektől. A

két állapot közötti átmenet a nukleotid kötése során nagy szabadenetgiaváltozással jár – tisztázatlan, hogy ehhez mennyiben járul hozzá a fehérje konformációjának megváltozása. Ezt a problémát céloztuk meg az 52 és 53 fejezetekben ismertetett kísérleteinkkel A fontos megoldandó kérdések között szerepel továbbá a terhelés hatása az ATP-áz ciklusra, amely minden bizonnyal módosítja annak kinetikáját. A fentiek alapján a miozin fej detektált nagy konformáció-változásainak bizonyosan fontos szerepük van a motor funkció betöltésében, a jelenlegi adatok birtokában azonban nem vázolható fel egyöntetű kép az erőgenerálás mechanizmusáról. Sokan sokat munkálkodhatnak tehát még a 26 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése történet folytatásán, és az előbbiekben vázolt problémák megoldását célozták meg a jelen dolgozatban ismertetett kísérleteink is. 27

Doktori értekezés 3 Célkitűzések 3.1 Triptofán szenzorok azonosítása és dinamikája Egy-triptofános motor domén mutánsok segítségével azt igyekeztünk felderíteni, hogy a fehérje mely triptofán oldallánca(i) járul(nak) hozzá a nukleotid kötésekor bekövetkező fluoreszcencia-változáshoz. Azt is vizsgáltuk, hogy a méréseinkben szenzorként funkcionáló triptofán oldalláncok dinamikája milyen kapcsolatban áll a molekula globális konformációs átmeneteivel. 3.2 A nukleotid-kötési lépések felbontása Célunk a kötési lépésekre igen érzékeny Dictyostelium motor domének létrehozása és jellemzése volt, amelyek az ATP-áz ciklus ezt követő eseményeire (pl. nyitott-zárt átmenet) nem mutatnak jelváltozást, így az ATP-kötési és ADP-felszabadulási lépések nagyfelbontású vizsgálatát teszik lehetővé. 3.3 A nyitott-zárt átmenet és az ATP-hidrolízis kapcsolata Az ATP-hidrolízis során az aktív helyen történő

szerkezeti változások áttevődnek az attól 3,5 nm-re elhelyezkedő W501 oldallánc környezetére is (relé-konverter régió). A konformációs átmenet a hidrolízissel látszólag egyidejűleg történik, a kristályszerkezetek tanúsága szerint azonban a miozin a hidrolízist csak a switch-II hurok zárt állapotában katalizálja. Kérdésünk arra irányult, hogy a nyitott-zárt átmenet és az ATP-hidrolízis kinetikailag elkülöníthetők-e, és ha igen, milyen kapcsoltság van e lépések között. 3.4 Az ATP-hidrolízis sebességének beállítása Ha a konformációs átmenet megelőzi a hidrolízis-lépést és kapcsoltság áll fenn közöttük, akkor a nyitott-zárt egyensúlyi állandó befolyásolja az ATP-hidrolízis sebességét. A miozin motor domén N- és C-terminális szubdoménjei között kiválasztottunk egy olyan kölcsönhatási felületet, amely csak nyitott konformációban jön létre. Egy ebben a régióban elhelyezkedő aminosavpár (K84, R704)

mutagenezise révén azt vizsgáltuk, hogy a kölcsönhatások megváltoztatása hogyan befolyásolja a nyitott-zárt egyensúlyt, illetve ezen keresztül a hidrolízis-lépést. 28 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése 4 Anyagok és módszerek 4.1 A kísérleti megközelítésről Kísérleteinkben géntechnológiai, spektroszkópiai, valamint steady-state és tranziens kinetikai technikákat alkalmaztunk. A Dictyostelium eukarióta rendszer lehetőséget nyújt miozin motor domén mutánsok kifejezésére. Vizsgálatainkhoz olyan, egy triptofánt tartalmazó mutánsokat terveztünk és állítottunk elő, amelyek az ATP-áz ciklus vizsgált lépéseire szelektív fluoreszcencia-változást mutatnak, lehetővé téve a részfolyamatok érzékeny felbontását. E mutánsok a vad típusú enzimmel lényegileg megegyező kinetikai tulajdonságokkal rendelkeztek. Előnyük egyrészt az, hogy mivel a fluoreszcencia-jel egyetlen

oldallánctól ered, a detektált szignál a molekula egy meghatározott régiójához rendelhető, másrészt pedig a többi, nem-szenzitív triptofán által okozott fluoreszcencia-háttér kiküszöbölésével lényegesen nagyobb jelváltozások detektálhatók. A mutáns motor domének steady-state fluoreszcens tulajdonságainak vizsgálata (fluoreszcenciaemissziós spektroszkópia, kvantumhatásfok- és anizotrópia-mérések, kioltási kísérletek) mellett steady-state és tranziens kinetikai méréseket végeztünk. A nukleotid-kötést illetve az ATPhidrolízist kísérő átmeneteket megállított áramlásos fluoreszcencia-mérésekkel követtük Az ATPhidrolízis lépés és az azt megelőző konformációs átmenet kinetikai paramétereinek meghatározásához perturbációs gyorskinetikai technikákat (hőugrás, nyomásugrás) használtunk, amelyek steady-state körülmények között is alkalmazhatók, holtidejük igen rövid, illetve lehetővé teszik egy szelektíven

perturbálható gyors lépés elválasztását az azt követő lassabb folyamattól. A vizsgált fehérjék fluoreszcencia-emissziójának életidő-komponenseit és anizotrópialecsengését időkorrelált egyfoton-számlálásos (TC-SPC) mérésekkel vizsgáltuk. 4.2 DNS konstrukciók elkészítése A mutáns DNS konstrukciókat a pDXA/M761 plazmid mutagenezisével állítottuk elő. Az említett konstrukció a Dictyostelium miozin II motor doménjét kódoló DNS szakaszt tartalmazza a pDXA-3H expressziós vektorba (lásd 4.3 fejezet) építve A rekombináns fehérjék a Dictyostelium miozin szekvencia 761. aminosaváig terjedő szakaszból állnak, N- és C-terminusuk módosított: MNP. helyett MDGTEDP (N-terminus) illetve R(761)LGSTRDALHHHHHHHH (Cterminus) (A mesterségesen bevitt aminosavakat aláhúzás jelöli) A W501+ konstrukció, amely a W501 kivételével valamennyi triptofán helyett fenilalanint tartalmaz, pGEM-11Zf(+) vektorba (Promega) történő szubklónozás után

Promega GeneEditor Kit segítségével készült (80). 29 Doktori értekezés A W113+, W129+ és W131+ egyetlen triptofánt tartalmazó konstrukciók előállításához a Wplazmidot (80) használtuk kiindulásul. Utóbbiban a motor domén kódoló régióban található mind a négy triptofán kodon fenilalaninra lett cserélve Promega GeneEditor Kit protokoll alapján. A további pontmutációkat PCR alapú mutagenezissel vittük be a W- konstrukcióba. A W129+/W501+ két-triptofános konstrukció a W129+ -hoz hasonlóan készült, azonban ebben az esetben a pDXA/W- helyett a pDXA/W501+ volt a kiindulási plazmid. A 84. illetve 704 pozíciókban pontmutációt tartalmazó konstrukciók elkészítéséhez is a pDXA/W501+ -ot használtuk fel kiindulásul. Az egyes konstrukciók elkészítésénél használt oligonukleotidok szekvenciáit és a restrikciós hasítóhelyeket, valamint a mutagenezis módját a 2. táblázat foglalja össze A DNS-manipulációs eljárásokat standard

protokollok (81) szerint végeztük. Valamennyi elkészült DNS konstrukciót szekvenálással ellenőriztünk (Perkin-Elmer ABI Prism 377). 4.3 Expressziós rendszer, fehérjepreparálás Működőképes miozin motor prokarióta gazdasejtben nem állítható elő, mert a felgombolyodásához miozin fej szükséges az eukarióta dajkafehérjék jelenléte. A Dictyostelium discoideum sejtes nyálkagomba rendszer rekombináns miozin motor domén fragmentumok termeltetésére nyújt lehetőséget, nagy kópiaszámú extrakromoszomális vektorok segítségével. Expressziós vektorként a pDXA6. ábra: A pDXA expressziós vektorok szerkezete ori: bakteriális replikációs origó, Ap : ampicillin rezisztencia gén, Ddp2 ori: Dictyostelium replikációs origó, Pact15: aktin promóter, MCS: multiklónozó hely, Tn5 neo: neomicin rezisztencia kazetta R 3H plazmidot használtuk ((26), 6. ábra) Ez a vektor E. coli-ban is klónozható (“shuttle” vektor), mivel tartalmaz a

bakteriális replikációhoz szükséges replikációs origót, valamint ampicillin rezisztencia gént. A Dictyostelium sejtekben történő replikációt, illetve a transzformánsok szelekcióját a Dictyostelium Ddp2 plazmidjának replikációs origója, illetve egy, részben a Tn5 transzpozonból származó neomicin- 30 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése rezisztencia kazetta teszi lehetővé. A rekombináns motor domének konstitutív expresszióját a Pact15 (aktin) promóter biztosítja. A plazmid tartalmazza az expresszióhoz szükséges terminátor szekvenciát is. A rekombináns fehérjék tisztítását C-terminális His-címke (HisTag) fúziós peptid segíti elő. A Dictyostelium sejteket 21oC-on növesztettük HL5-5C táptalajban (27). A plazmidokat elektroporációval vittük be a gazdasejtbe. A transzformánsokat 30 mg/l G418 (neomicin-analóg) alkalmazásával szelektáltuk. A termelt miozin

fragmentumok expressziós szintjét kis mennyiségű sejtlizátum közvetlen SDS-polialkrilamid gélelektroforézisével (82), illetve denaturáló közegben (7 M urea) végzett Ni2+NTA affinitás kromatográfiás tisztítás (HisBind Resin, Novagen) révén határoztuk meg. A rekombináns fehérjét kifejező sejtvonalakat rázatott (120 rpm) lombikokban 107/ml sejtkoncentrációig növesztettük. A sejtek PBS pufferben (100 mM NaCl, 50 mM NaPi, pH 7,0) való mosását, majd lízisét követően a motor 1 2 3 doméneket aktomiozin MgATP-vel végzett koprecipitáció extrakción után alapuló módszerrel (27) nyertük ki a csapadékból. Az 89 kDa Ni2+-NTA extraktumot affinitás kromatográfiával (HisBind Resin, Novagen) tisztítottuk, és a rekombináns fehérjét 0,45 M imidazollal (pH 7,3) eluáltuk az oszlopról, amit később dialízissel távolítottunk el az oldatból. A preparátum tisztaságát gélelektroforézissel 7. ábra: A rekombináns motor domének

expressziója SDS-poliakrilamid gélelektroforézis (9 %) 1: nem transzformált sejtvonal (Dictyostelium AX2) teljes sejtlizátuma, 2: miozin motor teljes domént expresszáló sejtvonal sejtlizátuma, 3: rekombináns motor domén (W129+) preparátum SDS-poliakrilamid ellenőriztük. A vázolt eljárással igen nagy tisztaságú (kb. 99%) motor domén preparátumokat tudtunk készíteni (7. ábra). A reagenssel Dictyostelium fehérjekoncentrációkat (Sigma) határoztuk kultúrákból Bradford meg. A literenként konstrukciótól függően 4-15 mg tiszta motor domént tudtunk előállítani. 4.4 Steady-state ATP-áz aktivitás mérése A mutáns motor domének bazális (aktin távollétében mért) MgATP-áz aktivitását piruvát kináz-laktát dehidrogenáz (PK/LDH, Sigma) kapcsolt reakción alapuló méréssel határoztuk meg 31 Doktori értekezés ((83), alkalmazott koncentrációk: 200 µM NADH, 400 µM PEP, 10 U/ml PK, 20 U/ml LDH). 1 mM ATP-nek (Sigma) a

fehérjemintához (3 µM) való hozzáadása után az oldatban lévő NADH koncentrációjának csökkenését 340 nm-en végzett abszorbancia-méréssel követtük (ε = 6220 M–1cm–1). A mérést 20oC-on végeztük 40 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 20 mM TES (pH 7,5) jelenlétében A következő fejezetekben, valamint az ábrák és a táblázatok szövegében a hőmérsékleti körülményeket és a mérési puffer összetételét csak akkor említjük, ha azok az itt leírtaktól eltérőek voltak. Az ATP-áz meghatározásának aktivitás egy alternatív lehetősége, hogy az ATP-nek az enzimhez kis (3-10-szeres) feleslegben való hozzáadása után a triptofán fluoreszcencia-változás követésével határozzuk meg a reakció végpontját (multiple turnover, 8. ábra) Ezt a módszert (kémiailag 8. ábra: ATP-áz aktivitás mérése multiple turnover kísérlettel A fehérjét néhányszoros feleslegben lévő ATP-vel keverjük össze, majd az ATP-áz reakció

steady-state szakaszának hosszát a megnövekedett fluoreszcencia alapján detektáljuk. Az ábrán 2 µM W501+ motor domén 10 µM ATP-vel történő reakciójának lefutása látható. módosítatlan ATP-vel) csak olyan mutánsok esetében lehet alkalmazni, amelyeknél az ATP-áz steady-state-ben legnagyobb arányban köztiállapot jelentősen jelen lévő fluoreszcenciája eltér a végállapotétól (ADP-kötött állapot). Minden olyan esetben, amikor ilyen módon is ellenőriztük az ATP-áz aktivitást, a PK/LDH kapcsolt tesztével egybevágó eredményeket kaptunk (a miozin KM-je ATP-re 10 nM körüli érték, így az e mérésnél alkalmazott 20-100 µM szubsztrát-koncentrációnál is már maximális sebesség mérhető). Megjegyzendő azonban, hogy az ADP által okozott termékgátlás ezekben a kísérletekben az ATPáz aktivitás kis mértékű alábecslését okozza. Az aktin-aktivált MgATP-áz aktivitás mérését a PK/LDH kapcsolt reakciónál leírtakhoz

hasonlóan végeztük, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM TES (pH 7,5) pufferben, 10-100 µM Faktin jelenlétében. 4.5 Steady-state fluoreszcencia-mérések A steady-state fluoreszcencia-méréseket SLM 48000 spektrofluoriméteren végeztük, termosztált mintatartóval, 5 mm úthosszú küvettában. Fényforrásként 200 W-os Hg-Xe, illetve 450 W-os Xe 32 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése lámpát alkalmaztunk. Azokban az esetekben, ahol a jó jel-zaj arány eléréséhez nagy intenzitású gerjesztő fényre volt szükség, a Hg-Xe lámpát használtuk, míg a hosszabb ideig tartó méréseknél a Xe lámpát alkalmaztuk, annak jobb intenzitás-stabilitása miatt. A fehérjemintában (3-10 µM) lévő triptofánokat 297 nm-en gerjesztettük, 1 nm széles rés alkalmazásával. A viszonylag hosszú gerjesztési hullámhossz és a keskeny sávszélesség három szempontból is jelentőséggel bír. (a) A W- triptofán-mentes

motor doménen végzett korábbi vizsgálatok tanúsága szerint az ilyen körülmények között gerjesztett minta tirozin fluoreszcencia-emissziója elhanyagolható a triptofán szignálhoz képest (80). (b) A fehérjéhez adott adenin nukleotidok fényelnyelése miatti belső szűrő effektus mértékét AMP hozzáadásával határoztuk meg. (Az AMP nem kötődik a miozinhoz, extinkciós együtthatója viszont megegyezik az ADP-ével illetve ATP-ével.) A vizsgálatok szerint, a leírt módon gerjesztve a mintát, az adenin csoport még magas koncentrációnál (1 mM) sem okoz 1-2 %-nál nagyobb szűrőhatást. (c) A gerjesztő fény által okozott, a fluoreszcencia csökkenését eredményező irreverzibilis változás („halványodás”, photobleaching) mértékét is ellenőriztük. Azt találtuk, hogy az ismertetett gerjesztési körülmények között a vizsgált időtartamokban nem volt észlehető ez a hatás. A fluoreszcencia-emisszió intenzitását monokromátoron

(4 nm rés-szélességgel), vagy WG320 és UG1110 optikai szűrőkön (Comar Instruments) keresztül detektáltuk. A mintában detektált fluoreszcencia-változások mértéke a gerjesztési hullámhosszon kívül függ attól is, hogy az emissziós oldalon hogyan különítjük el a fluoreszcens fényt a detektorba érkezés előtt. Az átmenő fényt adott hullámhossz-érték alatt vágó (long-pass cutoff) optikai szűrők alkalmazásával a teljes spektrális változásnál kisebb mértékű változások detektálhatók, ha a fluoreszcenciaintenzitás növekedése kékeltolódással jár együtt. Az ilyen beállítással viszont magasabb jelszint, és így jobb jel-zaj arány érhető el, ezért az időfelbontott méréseknél elsősorban ezt a megoldást alkalmaztuk. A steady-state kísérletek során, ahol a spektrális tisztaság és a teljes intenzitás-változás meghatározása volt a fontosabb szempont, elsősorban monokromátorral szelektáltuk a detektorba érkező

fényt. A WG320 illetve WG335 felüláteresztő (long-pass cutoff) optikai szűrők a 320 illetve 335 nm-nél hosszabb hullámhosszú fényt eresztik át, transzmittanciájuk az említett hullámhosszak körül élesen lecsökken (kb. 20 nm-es tartományban 0,9-ről 10–4-re; a megadott hullámhosszaknál T = 0,5). Ezért alkalmasak a 300 nm alatti gerjesztő fény szóródásából adódó háttér kiküszöbölésére. Az UG11 sávszűrő (band-pass) a 260-375 nm tartományban ereszt át, transzmittanciájának maximuma 345 nm-nél található (T = 0,6). Használatával a műszerbe kerülő látható fénynek a detektorba jutása akadályozható meg. 10 33 Doktori értekezés A fluoreszcencia hőmérsékletfüggésének vizsgálatakor a mintát vízcirkulációval, kb. 1oC/perc sebességgel hűtöttük. Az ATP-áz reakció steady-state szakaszában végzett fluoreszcencia-mérések után ellenőriztük, hogy a szubsztrát a mérés alatt nem fogyott olyan mértékben, ami

befolyásolná a kapott eredményeket. 4.51 Steady-state anizotrópia-mérések A steady-state fluoreszcencia-anizotrópia méréséhez Glan-Thomson prizma polarizátorokat alkalmaztunk. Mind T-, mind L-formátumban végeztünk méréseket A vertikálisan polarizált fénnyel gerjesztett minta fluoreszcencia-emissziójának vertikális (Ivv) illetve horizontális (Ivh) komponenseit a T-formátumú mérés esetén egyidejűleg detektáltuk, 335 nm-re állított (16 nm résszélesség) monokromátoron illetve WG320 – UG11 filter-kombináción keresztül. Az Lformátumú mérés során a vertikális és horizontális komponenseket egymás után mértük meg, az említett optikai filterek alkalmazásával. Az anizotrópia (r) értékeket G-faktor korrekció alkalmazásával számítottuk: r = (Ivv-GIvh)/(Ivv+2GIvh). A G-faktor értékét a horizontálisan polarizált fénnyel gerjesztett minta emissziójának vertikális (Ihv) illetve horizontális (Ihh) komponenseiből határoztuk meg

(G = Ihv/Ihh), és úgy állítottuk be a fotodetektorok érzékenységét, hogy ez 1-hez közeli érték legyen. 4.52 Kvantumhatásfok-mérések A fluoreszcencia kvantumhatásfokát az N-acetil-L-triptofán-amiddal (NATA)11 való összehasonlító méréssel határoztuk meg. A NATA (illetve a szabad triptofán) kvantumhatásfoka ismert érték (0,13) (84). A NATA és a mért fehérjék abszorpciós spektrumait Pye Unicam SP8100 spektrofotométerrel vettük fel A fluoreszcencia-emissziós spektrumokat „magic angle” polarizátor-beállítás mellett (gerjesztési oldalon vertikális, emissziós oldalon 54,7o-kal elfordítva a vertikálistól) rögzítettük12, és az SLM Instruments kalibrációs protokollja szerint korrigáltuk, hogy A NATA a fehérjékben lévő triptofán oldalláncok modellvegyületeként használatos. A polipeptidláncba épült triptofánhoz hasonlóan nem tartalmaz szabad, töltéssel rendelkező α-amino illetve α-karboxil csoportot, amelyeknek az

indolgyűrű fluoreszcenciájára gyakorolt kioltó hatása révén a szabad triptofán fluoreszcens sajátságai különböznek a fehérjékben található triptofán oldalláncokétól. A NATA-ban az indolgyűrű forgási szabadsága is jobban hasonlít a fehérje-triptofánokéhoz. 12 A minta által kibocsátott fluoreszcencia teljes intenzitása I = I +2*I T vv vh alakban írható fel, mivel a vertikálisan (a z tengely mentén) polarizált fénnyel gerjesztett fluorofór emissziós dipólusa mind az x (az emissziós oldalon horizontálisan beállított polarizátor vektorával párhuzamos), mind az y (az emissziós monokromátor felé haladó fény terjedési irányával párhuzamos) tengely mentén egyenlő eloszlásban sugároz polarizált fényt, amelyek közül Ivh-ban csak az előbbi jelenik meg. Az emissziós monokromátor hatékonysága függ a polarizáció irányától, ezért a mért intenzitás nem lesz arányos a teljes fluoreszcenciaintenzitással, hanem Ivv-nek és

Ivh-nak valamilyen más kombinációja lesz. Ha viszont a gerjesztési oldalon vertikálisra, az emissziós oldalon pedig a vertikálistól 54,7o-nyira elfordítva állítjuk be a polarizátorokat 11 34 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése a kapott integrálok révén valóban a teljes fluoreszcencia-intenzitások legyenek összehasonlíthatók. A kvantumhatásfokot Qminta = 0,13(Fminta/Aminta)/(FNATA/ANATA) alapján számítottuk, ahol F a teljes korrigált fluoreszcencia-emissziós spektrum alatti terület, míg A a minta abszorbanciája 297 nm-en. 4.53 Kioltási kísérletek A motor domén triptofánok oldószer-kitettségét akrilamiddal végzett fluoreszcencia-kioltási kísérletekkel vizsgáltuk. A különböző akrilamid-koncentrációjú (5-500 mM) minták fluoreszcencia-intenzitását közvetlenül az akrilamid hozzáadása után mértük meg (WG320 és UG11 emissziós filterek alkalmazásával), hogy

elimináljuk a kioltószer adása utáni lassabb fluoreszcencia-csökkenés hatását. A kapott adatokat a Stern-Volmer összefüggéshez illesztettük: Fo/F = 1+KSV[akrilamid] (Fo és F a kioltószer távollétében illetve jelenlétében mért fluoreszcencia-intenzitás, KSV pedig a dinamikus kioltási állandó). Az adatok jól illeszkedtek a lineáris összefüggéshez, ami lényegében egyféle (ez esetben dinamikus13) kioltási mechanizmusra utal (84). A fluoreszcencia-mérésekhez speciális minőségű, vanadát-mentes ATP-t használtunk (Roche Molecular Biochemicals). (A miozin igen stabil komplexet képez ADPVO4-tal) A többi nukleotidot a Sigma-tól szereztük be. A nukleotidoknak minden esetben a Mg2+-komplexeit adtuk a miozinhoz. A motor doménADPBeFx komplex készítésekor először 50 µM ADP-t és 3 mM NaF-ot, majd 50 µM BeCl2-ot adtunk a fehérjéhez (5-20 µM), és 30 percig inkubáltuk a mintát. A motor domén. ADPAlF4 komplex hasonlóan készült, 50 µM AlCl3

hozzáadásával BeCl2 helyett, illetve 2 órás inkubálási idővel. Mivel a komplexek fluoreszcenciája a vizsgált fehérjékben az apo állapotétól eltérő volt, képződésük kinetikáját a fluoreszcencia változásával tudtuk követni. 4.6 Időfelbontott fluoreszcencia-mérések Az időfelbontott fluoreszcencia-méréseket időkorrelált egyfoton-számlálásos (time-correlated single photon counting, TC-SPC) módszerrel végeztük (Central Laser Facility, Rutherford Appleton („magic angle”), a minta anizotrópiájától függetlenül Ivh-t kétszeres súllyal fogjuk mérni Ivv-hez képest (cos254,7o = 0,333 illetve sin254,7o = 0,667), és így IT-vel arányos intenzitást kapunk (84). 13 Dinamikus kioltási mechanizmus esetén a gerjesztett állapotban lévő fluorofórnak és a vele az oldószerből diffúzió útján közelségbe kerülő kioltó molekulának a kölcsönhatása okozza a kioltó hatást. Hosszabb életidő-tartományban nagyobb az ütközés

valószínűsége, a dinamikus kioltás emiatt az életidő rövidülését okozza. Statikus kioltás akkor jön létre, ha az alapállapotban lévő fluorofór nem-fluoreszcens, ún. “sötét komplexet” alkot a kioltószerrel A statikus kioltás a steady-state fluoreszcencia-intenzitást így az életidő megváltozása nélkül csökkenti. 35 Doktori értekezés Laboratory, Chilton). Fényforrásként egy frekvencia-kétszerezett, dinamikus kicsatolású, módusszinkronizált, szinkron-pumpált festéklézert (Spectra-Physics Model 3500) használtunk, amely a fehérjeminták (5-25 µM) 296 nm hullámhosszon való gerjesztését tette lehetővé. Az alkalmazott pulzusok frekvenciája 4 MHz, szélessége 10 ps volt. A fluoreszcencia-emissziót WG335 és UG11 szűrőkön keresztül detektáltuk, MCP-PMT (Hamamatsu, R3809U), 85 ps válaszidejű fotoelektron-sokszorozó csővel. Az időfelbontott anizotrópiát film-polarizátor (Halbo Optics, DPUV-25) segítségével mértük. A

vertikális és horizontális emisszió-komponenseket egymás után vettük fel. A fotoelektron-sokszorozónak a különböző irányban polarizált fényre való eltérő érzékenységét kiküszöbölendő a film-polarizátor és a detektor közé él-depolarizátort helyeztünk, így méréseink során 1 volt a G-faktor értéke. Az életidő-mérésekhez a fluoreszcencia-emisszió teljes intenzitását Iv+2Ih alapján számítottuk (84). Az adatokat 1024 csatornába gyűjtöttük (csatorna-szélesség: 40 ps) SPC-700 PC-kártya modul segítségével (Becker and Hickl GmbH, Berlin), amely az egyfoton-számlálásos mérés standard funkcióinak (TAC (time-to-amplitude converter), CFD (constant fraction discriminator), lásd (84)) irányítását is végezte. 4.7 Megállított áramlásos mérések A megállított áramlásos (stopped-flow) kísérleteket (lásd 9. ábra) Applied Photophysics SX18MV készüléken végeztük (Department of Biochemistry, University of

Leicester). Fényforrásként Xe lámpát használtunk, 295 nm gerjesztési hullámhosszal (rés-szélesség: 2-4 nm). A fluoreszcencia-emissziót WG320 (vagy WG335) és UG11 optikai szűrőkön keresztül detektáltuk. A műszer holtidejének (a reakció számított kezdőpontja és a megfigyelés kezdete 9. ábra: Megállított áramlásos mérőműszer sémája A reagensek a lökést követően a keverőkamrán keresztül az optikai cellába jutnak, ahol az áramlás megállása után a reakció lefutása követhető. között eltelt idő) méréséhez a NATA (5 µM) Nbromo-szukcinimiddel (NBS, 50-400 µM) történő reakciójának tranzienseit vettük fel14 (85). Kétféle mintacellát alkalmaztunk (térfogat: 20 14 Az egylépéses reakció lefutását pszeudo-elsőrendű körülmények között (az NBS-t 10-80-szoros feleslegben adva) vettük fel, így egyfázisú exponenciális tranzienseket kaptunk. Az illesztett függvényeket a megfigyelés kezdete előtti

idő-szakaszra extrapolálva a különböző NBS-koncentrációknál kapott görbék metszéspontja kijelöli a reakció számított kezdőpontját (85). A reakció megfigyelése onnan kezdődik, ahol a kísérleti görbe már nem tér el szisztematikusan az illesztett függvénytől. 36 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése illetve 5 µl), amelyekkel 1,5 illetve 0,5 ms holtidőt határoztunk meg. Az 5 µl-es cella használata a gyors (> 500 s–1) folyamatok jobb felbontását teszi lehetővé a háromszor rövidebb holtidő jóvoltából, figyelembe véve azt is, hogy jelszintje csak 40 %-kal alacsonyabb a 20 µl-es cellához képest. Az adatokat logaritmikus időbeosztású mintavételezéssel (rekordonként 1000 pont) vettük fel annak érdekében, hogy a többlépéses folyamatok valamennyi fázisának analíziséhez elegendő adatpont álljon rendelkezésre. A lökések idő-profilját a készülékbe épített, a

dugattyú pozícióját jelző potenciométer segítségével ellenőriztük. A megállított áramlásos kísérletek leírásakor mindig a reakciócellabeli koncentrációkat említjük. 4.8 Relaxációs kinetikai kísérletek A kémiai reakciók egyensúlyi állandója kisebbnagyobb mértékben függ olyan „külső” fizikai paraméterektől, mint például a nyomás, a hőmérséklet vagy az elektromos térerő. A relaxációs kísérletek során valamely paraméter gyors megváltoztatását követően detektáljuk a reakcióelegy összetételének időbeli változását (10. ábra) a sebességi állandók meghatározása céljából. A relaxációs kísérletek előnye egyrészt, hogy igen gyors folyamatok (10–6 s) is követhetők, másrészt összetett reakciók esetén az egyes lépések szelektív perturbációja révén a gyorskeveréses technikákkal nem detektálható folyamatok is „láthatóvá” 10. ábra: A relaxációs kísérletek általános sémája A

külső fizikai paraméter gyors megváltozását a komponensek loncentrációjának a sebességi állandók által meghatározott lefutású megváltozása követi (79). 4.81 válhatnak. Hőugrás A hőugrásos (temperature-jump) kísérleteket (lásd 11. ábra) Hi-Tech Scientific TJ-64 műszerrel végeztük (Department of Biochemistry, University of Leicester). A mintát 297 nm-en gerjesztettük 75 W-os Hg-Xe lámpával (Hamamatsu Photonics), 297FS 10-25 interferenciaszűrőn (Androver Corp.) keresztül A fluoreszcencia-emissziót WG320 és UG11 filtereken 37 Doktori értekezés keresztül detektáltuk. 100 µl-es mintacellát használtunk, 3 mm-es fényúttal. A hőugrást keresztüli 10 kV-os a cellán elektromos kisüléssel indukáltuk, amely kb. 5oCnyi ugrást eredményezett (kiindulási hőmérséklet: 16oC). Ahhoz, hogy a minta elektromos és hővezetése megfelelő legyen, más kísérletekhez képest nagyobb ionerősségű mérési 11. ábra:

Hőugrásos mérőműszer sémája puffert kellett használni (60 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 20 mM TES pH 7,5). Ilyen körülmények között a hőugrás 50 µs alatt következett be. A minta hűlésének „féléletideje” 3 s körüli érték volt (a hűlés lecsengése nem volt egyfázisú exponenciális). A hőugrásokat 150 s-onként ismételtük a mintán 4.82 Nyomásugrás A nyomásugrásos (pressure-jump) mérőműszer (Research School of Biosciences, University of Kent at Canterbury) Clegg és Maxfeld eredeti konstrukciója (86) alapján került összeállításra, azonban annál kisebb mintakamrát (50 µl) és két kis térfogatú nyomásszelepet tartalmaz (12. ábra). A mintakamra egy 2 mm belső és 5 mm külső átmérőjű zafír gyűrű, amelynek egyik végét egy nyomás-szenzor (Kistler 601A), másik végét pedig egy vékony membrán (0,003’’ Kaptan V, Du Pont), illetve nyomásgenerátorhoz 12. ábra: Nyomásugrásos mérőműszer sémája egy

piezo-elektromos (Physik Instrumente P245.30) csatolt dugattyú zárja le A kamrában 80 bar-os nyomásugrás kb. 80 µs alatt zajlott le mind növekvő, mind csökkenő irányban. Az adatfelvétel idejétől függően, maximum 12,5 Hz frekvenciával indukáltuk a nyomásugrásokat. A 100 W-os Hg-Xe lámpával 297 nm-en (2,5 nm rés-szélességnél) gerjesztett minta fluoreszcenciáját WG320 filteren keresztül detektáltuk. 38 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése 4.9 Adatok feldolgozása és kiértékelése A mérőműszerekhez tartozó szoftverekkel rögzített adatok kiértékelését, illetve az elméleti görbéknek a kísérleti adatokhoz való illesztését és az illesztett görbék statisztikai analízisét Origin 6.0 (Microcal Software), Archimedes és Microsoft Excel 2000 programok segítségével végeztük el. Kísérleteink túlnyomó többségét pszeudo-elsőrendű reakciókörülmények között

végeztük Azokban az esetekben, amikor a vizsgált kinetikai sémához nem állt rendelkezésre analitikus megoldás, exponenciális közelítéseket alkalmaztunk. A kinetikai szimulációkat KinTekSim programmal (KinTek Corp.) végeztük A kísérleti eredmények ismertetésekor a mérések átlagától való standard eltérést csak akkor említjük, ha az meghaladta a 2 %-ot. A tranziens kinetikai mérések során annyi ismétlést végeztünk, hogy a kapott jel-zaj arány mellett az illesztett paraméterek hibája ne legyen nagyobb 1-2 %-nál. Ehhez a megállított áramlásos mérések esetén adatpontonként 8-50, a hőugrásos kísérletekben 50-100, a nyomásugrásos méréseknél pedig 500-5000 ismétlésre volt szükség. 39 Doktori értekezés 5 Eredmények és megbeszélésük 5.1 Miért éppen a motor domén? Annak megértéséhez, hogy az aktomiozin rendszer hogyan alakítja át az ATP-hidrolízis reakció során felszabaduló kémiai energiát irányított

mechanikai munkává, elengedhetetlenül szükséges a miozin ATP-áz enzimatikus ciklus részletes vizsgálata. A miozin aktív helyén történő kémiai események és az erőgenerálás közti csatoltság meghatározása kulcsfontosságú kérdés az energiaátalakítás mechanizmusában. A miozin motor doménje tartalmazza mind az aktin, mind a nukleotid kötőhelyét, és a teljes fehérjével megegyező enzimatikus sajátságokkal rendelkezik. A motor domén konstrukciókból hiányzik a molekula könnyűláncokat is tartalmazó „nyaki” része, amelynek egyrészt egyes izoformáknál az enzimműködés szabályozásában, másrészt a konformáció-változások térbeli felerősítésében („erőkar”) van szerepe. Az erőkar-kilengés csuklópontja azonban a motor doménen belül található (70), így ez a domén önmagában is alkalmas mind a katalízissel, mind az erőgenerálással kapcsolatos jelenségek vizsgálatára. Az irányított mutagenezisen alapuló

kísérleti megközelítésnél fontos szempont a rekombináns fehérje jó kitermelése. Az egyetlen polipeptid-láncból álló motor doméneknek a Dictyostelium eukarióta rendszerben való előállítására részletesen kidolgozott metodika áll rendelkezésre (26, 27). A motor domén konstrukciók további előnye, hogy a számos triptofánt tartalmazó nyaki régió miatt viszonylag kevés (3-4) mutáció bevitelével állíthatók elő egy-triptofános fehérjék. Valamennyi eddig ismert kísérleti adat arra utal, hogy a különböző fajokból származó konvencionális miozin ortológok ATP-áz mechanizmusa ugyanazokból az alapvető lépésekből áll, és a szerkezeti adatok is hasonló globális konformációs átmenetekről tanúskodnak (46). Ezért a Dictyostelium nyálkagomba miozinon végzett kísérletek – amely izoforma egyébiránt mára e motorfehérjék biokémiai vizsgálatának egyik legfontosabb objektumává vált – a konvencionális miozinok általános

mechanizmusáról szolgáltatnak hasznos információt. A kísérleteinkben használt mutánsok az M761 motor doménbe épített pontmutációkat tartalmaznak, amely konstrukció a globuláris domén C-terminális határánál ér véget. Az M761 enzimatikus tulajdonságai – egyes tovább rövidített változatokkal (pl. M754) ellentétben – megegyeznek a teljes miozinéval (65). E helyütt megjegyzendő, hogy a kristályosítási és a korábbi kinetikai vizsgálatok során egy két aminosavval rövidebb konstrukciót (M759) használtak, amelynek a kinetikai sajátságai nem különböznek az M761-étől (87). 40 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése Az ebben a fejezetben ismertetett eredmények a miozin motor működésével kapcsolatos négy kérdéskör – négy „történet” – köré csoportosulnak, ezért tárgyalásuk során az egyes gondolatmenetek folyamatos végigvezetését részesítettem előnyben az

eredményeknek és a diszkussziónak a közleményekben szokásos, különálló fejezetekbe történő felosztásával szemben. Így kérdéskörönként a probléma rövid felvázolása előzi meg az eredmények ismertetését, amely után közvetlenül azok megbeszélése következik. 41 Doktori értekezés 5.2 Triptofán szenzorok a motor doménben – fluoreszcencia-változások, molekuláris dinamika és a jelek eredete Olyan triptofán szenzorokat kerestünk a miozin motor doménben, amelyek az ATP-áz ciklus egyes lépéseire szelektíven érzékenyek és nagy fluoreszcencia-változásokat mutatnak. Milyen összefüggés van a szenzorok molekuláris dinamikája és a fehérjemolekula globális konformációs átmenetei között? 5.21 Intrinsic próbák a miozin fejben A miozin fejben végbemenő változások követéséhez a molekula intrinsic (triptofán) fluoreszcencia-jelét használtuk fel. Fluoreszcencia-intenzitását tekintve a triptofán viszonylag

„gyenge” fluorofór a biokémiai vizsgálatokban alkalmazott extrinsic próbákhoz képest (εmax(280 nm) = 5050 M–1cm–1, kvantumhatásfok (vízben): 0,13). Előnye viszont, hogy a vizsgálni kívánt fehérjén nem kell kémiai módosítást eszközölni. A tirozin háttér-fluoreszcencia viszonylag hosszú (>295 nm) hullámhosszon történő gerjesztéssel küszöbölhető ki. A kinetikai méréseknél fontos szempont az egyes lépésekre minél nagyobb jelváltozást mutató molekulák használata. Ez egyrészt a felvett időgörbék jó jel-zaj arányához szükséges (amely, mint később látni fogjuk, sok esetben sarkalatos szempont a görbék analízisénél), másrészt pedig azért, mert egyes mérések során (pl. a steady-state fluoreszcencia hőmérsékletfüggése vagy a relaxációs kísérletek esetén) a különböző állapotokban lévő fehérjemolekulák arányában bekövetkező igen kis változásokat kell detektálni. A vázizom miozin S1, illetve a

vad típusú Dictyostelium motor domén viszonylag kis (5-10 %) fluoreszcencia-változást mutat az ATP-vel történő reakció során (előbbi 5, utóbbi 4 triptofánt tartalmaz). A kis változás oka lehet a molekula globális konformáció-változásaira nem érzékeny, a viszonylag rigid szubdomének hidrofób magjában „eltemetett” triptofán oldalláncok okozta magas fluoreszcencia-háttér. Vizsgálatainkhoz ezért ezen változásokra érzékeny pozícióban egyetlen triptofánt tartalmazó mutáns Dictyostelium motor domén konstrukciókat terveztünk nagy jelváltozások reményében. A géntechnológiai módszerekkel előállított egy-triptofános fehérjék vizsgálata azzal a fontos előnnyel is jár, hogy a mért spektroszkópiai szignál egyértelműen hozzárendelhető a fehérjemolekula egyetlen oldalláncához. 5.22 A relé-hurok triptofán: egy „természetes” riporter Az ATP-vel történő kölcsönhatás során mind vázizom miozin, mind simaizom miozin

S1ben, mind pedig Dictyostelium miozin motor doménben fluoreszcencia-emelkedés következik be. Váz- és simaizom miozinban nem-hidrolizálható nukleotidok (pl. ADP) is okoznak az előbbinél 42 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése kisebb mértékű emelkedést. Ez arra utal, hogy a miozin fejben mind a nukleotid-kötési, mind pedig az ATP-hidrolízis lépés során történik fluoreszcencia-emelkedés, amit az a megfigyelés is alátámaszt, hogy ATP hozzáadásakor a változás két fázisban történik (61). Géntechnológiai módszerekkel, illetve helyspecifikus kémiai módosítással igazolták, hogy a hidrolízissel egyidejű emelkedésért mindhárom izoformában a fej relé-konverter régiójában elhelyezkedő konzervatív triptofán oldallánc (vázizom miozinban W510, simaizom miozinban W512, Dictyostelium miozinban W501) felelős (80, 88-91). A kristályszerkezetek alapján ez a régió jelentős szerkezeti

változáson megy keresztül a nyitott-zárt átalakuláskor, amelynek során a konverter régió elfordul a relé-hélix és -hurok körül (13. ábra) 13. ábra: A relé-hurok triptofán elhelyezkedése a motor domén zárt és nyitott térszerkezeteiben A kötött ligandum lila, az erőkar narancs, illetve kék, a relé-hurok triptofán zöld színnel került feltüntetésre. 1 Fluoreszcencia-intenzitás 1 apo wt 0.8 . +ATP 0.8 +ADP.AlF4 W501- 0.6 0.6 + ATP apo 0.4 0.4 W501+ + ADP 0.2 0.2 W0 300 320 340 360 380 400 Hullámhossz (nm) 14. ábra: A vad típusú, illetve W501+, W501- és W- motor domének fluoreszcencia-emissziós spektrumai (80) A W501+ és W- mutánsok leírását lásd a 2. táblázatban A W501- konstrukció W501F mutációt tartalmaz. 0 300 320 340 360 380 400 Hullámhossz (nm) 15. ábra: A W501+ mutáns emissziós spektrumai nukleotid-mentes állapotban, illetve ADP, ATP és ADP.AlF4 jelenlétében (80) 43 Doktori

értekezés A W501+ egy-triptofános Dictyostelium miozin motor domén mutáns, amely a W501 kivételével valamennyi triptofán helyett fenilalanint tartalmaz, a vad típusú fehérje enzimatikus sajátságainak megtartása mellett igen jelentős fluoreszcencia intenzitás-változást mutat ATP, illetve ADP hozzáadására [+100 % (zárt konformáció), illetve –15-20 % (nyitott konformáció)], amelyeket kékeltolódás kísér (14-15. ábra) (80) Ezen kedvező sajátságai miatt ezt a mutánst használtuk a nyitott-zárt átmenet és a hidrolízis kinetikájának tanulmányozására (5.4 és 55 fejezetek), illetve a W501 oldallánc dinamikáját is vizsgáltuk (5.24 - 527 fejezetek) 5.23 Triptofán szenzorok a nukleotid kötőzsebben A vázizom miozin nukleotid kötőzsebének közvetlen szomszédságában két triptofán (W113 és W131) is található, így felmerült, hogy ezen oldalláncok valamelyike (vagy mindkettő) felelős a kötéskor jelentkező

fluoreszcencia-emelkedésért. Ezt látszott alátámasztani az a megfigyelés is, hogy a Dictyostelium miozin, amely a kötőhely környékén nem tartalmaz triptofánt, csak igen kis fluoreszcencia-változást mutat ADP hozzáadására (87). A fenti megfontolások alapján a nukleotid-kötési lépések nagyfelbontású kinetikai vizsgálatához olyan Dictyostelium motor domén mutánsokat terveztünk, amelyek a kötőhely szomszédságában elhelyezkedő egyetlen triptofánt tartalmaznak. Korábbi munkák során bebizonyosodott, hogy a vad típusú motor domén valamennyi triptofánja helyett fenilalanint tartalmazó konstrukció (W-) kinetikai sajátságai hasonlóak a módosítatlan enziméhez (80), így ebbe a konstrukcióba építettük be triptofán szenzorainkat. A következő konstrukciókat készítettük el: (a) A W113+ és W131+ konstrukciók a vázizom miozinnal homológ pozícióban tartalmaznak egy-egy triptofánt. A W113 a konzervatív K130 oldallánccal való

kölcsönhatás révén mutathat fluoreszcencia-változást a nukleotid kötésére, míg a W131 a kötött nukleotid adenin csoportjának közvetlen közelében található a kristályszerkezetekben (16-17. ábra), amely molekularésznek kioltó hatása lehet a triptofán fluoreszcenciára. (b) A W129+ mutánsban a triptofánhoz hasonló kémiai jellegű F129 oldallánc kicserélésével építettünk be egy triptofánt szintén az adenin csoport tőszomszédságába (17. ábra) (Ebben a pozícióban majdnem minden eddig leírt miozin osztályban aromás oldalláncú aminosav található (92).) (c) A W129+/W501+ két-triptofános konstrukció a nukleotid-kötőhelynél (W129) és a reléhurokban (W501) tartalmaz egy-egy triptofán szenzort. 44 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése nukleotid aktin kötőhely kötőhely 16. ábra: A nukleotid kötőhely 113 illetve 129-131 aminosav-pozícióinak elhelyezkedése a

Dictyostelium miozin motor doménben (vö. a 17 ábrával) W131+ W113+ W129+ Dictyostelium miozin vázizom miozin 17. ábra: A beépített triptofán szenzorok pozíciója a kötött nukleotidhoz képest a Dictyostelium motor domén szerkezetében, összehasonlítva a vázizom miozin homológ pozícióival 5.231 A nukleotid kötőhelynél elhelyezkedő triptofánok fluoreszcencia-változásai Az adenin csoport mellett apo apo elhelyezkedő .-ADP ATP - - -v.ATP mazó v. ADP W131+) triptofánt mutánsok tartal- (W129+, fluoreszcencia-inten- zitása jelentősen csökkent ADP F hozzáadására csökkenés (18. mértéke ábra). A W129+ esetén 55 %, W131+ esetében 30 % volt, és mindkét esetben Hullámhossz (nm) 18. ábra: Az egy-triptofános motor domének fluoreszcencia-emissziós spektrumai apo és nukleotid-kötött állapotban jelentős kékeltolódással járt együtt (3. táblázat) A W113+ konstrukció csekély (3-5 %-os) 45 Doktori

értekezés fluoreszcencia-emelkedést és vöröseltolódást mutatott ADP hozzáadására. ATP illetve nukleotidanalógok (AMPPNP, ADPBeFx, ADPAlF4) kötésére mindhárom mutáns az ADP-kötéssel megegyező vagy attól csak kis mértékben (1-2 %) eltérő változást mutatott, ami arra utal, hogy a kötőhely mellett elhelyezkedő triptofánok csak a nukleotid-kötési lépésekre érzékenyek, az ATPáz ciklus további eseményeire (pl. a nyitott-zárt konformációs átmenetre) nem, ami fontos szempont a tranziens kinetikai analízisnél is (5.3 fejezet) A pirofoszfát kötődése a W129+ motor doménhez nagy (60 %-os) fluoreszcencia-emelkedést és vöröseltolódást okozott (3. táblázat) A kristályszerkezetekben a pirofoszfát az aktívhely β- és γ-foszfát kötőhelyeit foglalja el (40). A tapasztalt emelkedés azt sugallja, hogy a nukleotid-kötés okozta nagy csökkenésben jelentősebb szerepe van az adenin csoport direkt kioltó hatásának, mint a W129 indol és

más fehérje-oldalláncok közötti kölcsönhatások megváltozásának. 5.24 Változások alap- és gerjesztett állapotban, kvantumhatásfokban, oldószerkitettségben A W501+ mutáns abszorbanciája ATP hozzáadására 14%-kal növekszik, majd az ATP hidrolízise után (ADP állapot) az apo állapotra jellemző értékre áll vissza. A W129+ mutáns abszorbanciája nem változik jelentősen nukleotid-kötés hatására. Ezekből az adatokból kitűnik, hogy jóllehet a W501+ esetén az alapállapotban is van némi változás, az egyes állapotok fluoreszcencia-intenzitás változásaiért, illetve a kvantumhatásfokban bekövetkező változásokért (3. táblázat) elsősorban a fluoreszcencia-emisszió sajátságainak megváltozása felelős A W129+ mutánson akrilamiddal apo 1.8 ATP végzett kioltási kísérleteink azt mutatták, hogy a dinamikus kioltási állandó Fo/F 1.6 ADP nukleotid-kötés hatására kb. a felére csökken (19. ábra, 3 táblázat) Eszerint 1.4

a ligandum kötésekor a W129 oldallánc 1.2 oldószernek való kitettsége jelentősen W129+ 1.0 0 100 200 300 400 [akrilamid] (mM) 19. ábra: Fluoreszcencia-kioltás akrilamiddal a W129+ motor doménben Az adatokat a Stern-Volmer összefüggéshez illesztettük: Fo/F = 1+KSV[akrilamid] (Fo és F a kioltószer távollétében illetve jelenlétében mért fluoreszcencia-intenzitás, KSV pedig a dinamikus kioltási állandó). 46 lecsökken. A jodiddal, illetve akrilamiddal végzett korábbi kísérletek (80, 89, 90) azt mutatták, hogy a nukleotid kötésekor csökken a reléhurok triptofán oldallánc (W501 illetve homológ pozíciók) oldószer-kitettsége, és a hidrolízissel egyidejűleg további Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése csökkenés tapasztalható. A W129+ mutáns esetében az ATP steady-state-ben valamivel alacsonyabb a dinamikus kioltási állandó, mint ADP-ben. A kapott eredmények

összhangban vannak a kristályszerkezeti megfigyelésekkel, amelyek azt mutatják, hogy a vizsgált oldalláncok nukleotid-kötött állapotban is részlegesen hozzáférhetők az oldószer számára. Apo állapotban oldószer-kitettségük még kifejezettebb. 5.25 Életidő-komponensek és a triptofánok dinamikája Az ismert nyitott konformációjú Dictyostelium miozin motor domén szerkezetekben - két kivétellel – nem látható a W501 oldallánc, míg a zárt struktúrák a relé-hurok rigidebb elrendeződésére utalnak. Ez alapot adhat arra a feltételezésre, miszerint a nyitott-zárt konformációs átalakulás a relé-hurok flexibilisebb konformációjából egy rendezettebb struktúrába való átmenetével jár együtt, amelyben a W501 oldallánc az oldószertől védettebb állapotba kerül. Ez magyarázhatja a konformációs átmenettel járó nagy fluoreszcencia-növekedést. Ennek a hipotézisnek a vizsgálatára időfelbontott fluoreszcencia-méréseket

végeztünk a W501+ motor doménen. A W129+ mutáns időfelbontott fluoreszcens sajátságait is vizsgáltuk a nagy fluoreszcencia-változás okának felderítése érdekében. Az 5 triptofánt tartalmazó miozin S1-en végzett korábbi triptofán fluoreszcencia életidő vizsgálatokkal 3 életidő-komponenst (0,72 ns, 4,5 ns illetve 8,8 ns) mutattak ki, ami alapján a triptofánokat három osztályba sorolták (93). Ismert tény azonban, hogy az egy-triptofános fehérjék intenzitás-lecsengése is többfázisú lehet (84). A vizsgálatainkban kontrollként mért humán szérum albumin (HSA) egyetlen, a molekula belsejében eltemetett triptofánt tartalmaz. Ez a fehérje is az előző jelenségre szolgáltat példát: intenzitás-lecsengésében 1,3 ns-os és 6,0 ns-os 10 5 10 4 10 Fotonszám Fotonszám komponenseket azonosítottunk, jó egyezésben a korábbi adatokkal (94). 3 10 5 10 4 ATP apo ADP 10 3 W501+ 2 0 5 10 15 20 25 30 apo ADP ATP W129+ 10

35 Idõ (ns) 20. ábra: A W129+ motor domén fluoreszcencia intenzitáslecsengési görbéi A lecsengési profilokhoz kétfázisú exponenciálisokat illesztettünk. Az ezekből számított paramétereket a 3. táblázat tartalmazza 0 5 10 15 20 Idõ (ns) 21. ábra: A W501+ motor domén fluoreszcencia intenzitás-lecsengési görbéi 47 Doktori értekezés A W129+ és W501+ mutánsokon végzett intenzitás-lecsengési vizsgálatok arra mutattak rá, hogy a különböző steady-state fluoreszcencia-intenzitású állapotok emissziója ugyanolyan életidőkomponensekből (5 ns illetve 1 ns körüli) tevődik össze (20-21. ábra, 3 táblázat) Az életidők a két különböző fehérjében hasonlóak voltak. Az apo állapothoz képest a W501+ fluoreszcenciaemissziójában ATP-ben nagyobb, míg ADP-ben kisebb az 5 ns-os komponens relatív amplitúdója. W129+ esetén mindkét nukleotid-kötött állapotban az 5 ns komponens részesedésének csökkenését figyelhetjük

meg. Ezen változások iránya egybevág a steady-state fluoreszcencia-változásokéval, a változásokban tehát szerepet játszik egy dinamikus kioltási komponens. A normalizált lecsengési görbék alatti terület megváltozása azonban lényegesen kisebb, mint a teljes, nem-korrigált intenzitás-görbék esetén, amiből arra lehet következtetni, hogy a fluoreszcencia-változásokban jelentős hozzájárulása van egy statikusan kioltott komponensnek is. A lecsengési profilokból és a W501+ illetve W129+ fluoreszcencia kvantumhatásfokából a statikusan kioltott komponens részaránya a különböző állapotokban kiszámítható. Ehhez fel kell használni a triptofán fluoreszcencia intrinsic életidejét (16 ns)15. τátlag = (A1τ1+A2τ2)/(A1+A2) statikus komponens részaránya (%) = 100(1- Qminta. 16 ns/τátlag ) W129+ apo statikus 1 ns A W501+ motor domén esetén apo 5 ns ATP állapothoz képest ATP-ben nagyobb az 5 ADP ns-os W501+ apo komponens

részaránya, míg a ATP statikusan kioltotté csökken (22. ábra, 3 ADP táblázat). ADP-ben ennél kisebb mértékű, 0% 20% 40% 60% 80% 100% 22. ábra: A W129+ és W501+ fluoreszcencia-emisszió komponenseinek részaránya apo, ADP és ATP-kötött állapotban (A komponensek részarányának számítási módját lásd a szövegben) fordított irányú változás figyelhető meg. Az 1 ns-os komponens részaránya közel állandó maradt mindhárom állapotban. W129+ esetében a nukleotid-kötés okozta fluoreszcencia-csökkenés egyrészt a statikus komponens részarányának jelentős növekedésével, másrészt az 5 ns-os és 1 ns-os komponenseknél az utóbbi irányába való eltolódással jár. 15 Használt rövidítések: A: amplitúdó, τ: életidő, Q: kvantumhatásfok 48 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése Korábbi leírások beszámolnak arról, hogy az 5 ns-os komponens megjelenése a

triptofán fluoreszcenciában az indol gyűrű fotokonverziójának eredménye is lehet. Esetünkben ez azonban nem erről van szó, mivel az ATP hidrolízise után a W501+ mutáns fluoreszcenciájában az 5 ns-os komponens részaránya visszaáll az ADP állapotra jellemző alacsonyabb értékre, ami azt mutatja, hogy az említett változások valóban a molekula globális konformáció-változásaival hozhatók összefüggésbe. W129+ esetén a statikus komponens részarányának növekedése felelős a steady-state fluoreszcencia-változás 2/3-áért, ami arra utal, hogy a kötött nukleotid közeli adenin gyűrűje és a W129 indol csoport közötti „sötét komplex” keletkezésének szerepe lehet a kötéskor megfigyelt jelentős csökkenésben. A steady-state fluoreszcencia-intenzitás változásait tehát a három komponens részarányának eltolódása okozza, ami azt mutatja, hogy a W501 illetve W129 oldallánc valamennyi (nukleotidmentes illetve különböző

nukleotidokkal komplexben lévő) állapotban különböző kémiai környezetet biztosító „szubállapotok” között oszcillál, amely mozgások időtartománya a fluoreszcencia-életidő és a molekula nagy konformációs átmeneteinek időskálája közé esik (>5 ns és <20 µs). Ezen megfigyeléseink azt mutatják, hogy egyrészt a nukleotid-mentes illetve a különböző nukleotid-kötött állapotokhoz nem rendelhető egyértelműen a vizsgált oldalláncok és a környező aminosavak egyféle konformációja, másrészről az eredmények összhangban vannak azzal a megfigyeléssel, hogy a motor domén ugyanazon konformáció-állapotában a W501 oldallánc különböző rotamerjei azonosíthatók (29). 5.26 Steady-state és időfelbontott anizotrópia Mindhárom vizsgált mutáns (W129+, W131+, W501+) viszonylag magas (0,2 körüli) steadystate anizotrópia értéket mutatott (3. táblázat) W501+ esetén az anizotrópia értéke (0,21) csekély növekedést

mutatott 90% glicerinben (0,23), viszont 0,1-re esett 6,6 M GuHCl-dal történő denaturáció hatására. Ez azt jelzi, hogy a vizsgált oldalláncok a teljes fehérjéhez képest immobilisak, illetve hogy a fehérje konformációs mozgásainak az oldószer viszkozitásának növelésével történő lassítása/blokkolása csekély hatással van az indol gyűrű mobilitására. Az elméletileg lehetséges maximális 0,4 anizotrópia értéktől való eltérés egyrészt a fluorofór gerjesztési és emissziós dipólusainak irányai közti eltérésből, másrészt az oldallánc kis amplitúdójú, gyors (< 1 ns) mozgásaiból adódhat. Az anizotrópia W501+ esetén nem változott jelentősen nukleotid hozzáadására, W129+-ban és W131+-ban viszont csekély növekedés volt megfigyelhető. 49 Doktori értekezés Az időfelbontott trópia-mérésből 0.25 0 anizo- időpontra extrapolált anizo-trópia-értékek Anizotrópia 0.20 ATP ADP 0.15 apo 0.10 state

értékeknél (3. táblázat), ami abból adódhat, hogy az e méréseknél polarizátor 0.05 szét W129+ 0.00 alacsonyabbak voltak a steady- 0 5 10 15 20 25 30 35 Idõ (ns) 23. ábra: A W129+ fluoreszcencia anizotrópia-lecsengési profilja Az időfelbontott anizotrópia-értékeket a vertikális illetve horizontális emisszió-komponensek intenzitás-lecsengéséből számítottuk (lásd a 4.51 illetve 46 fejezetekben), és 0-hoz tartó egyfázisú exponenciálisokhoz illesztettük. A W501+ mutáns hasonló profiljainak bemutatásától eltekintek. A lecsengési időket a 3. táblázat tartalmazza a használt film- kevésbé választja különböző irányban polarizált fénykomponenseket, mint a steady-state kísérleteknél használt Glan-Thomson prizma polarizátor. A 20 ns-nál hosszabb anizotrópia-lecsengési idők pontos meghatározását a triptofán rövid életideje nehezíti, azonban elméleti megfontolások alapján alkalmazható a 0-hoz tartó

exponenciális illesztés. A lecsengési idők mind W501+-nál, mind W129+-nál a teljes fehérjemolekula rotációs korrelációs idejének tartományába estek (3. táblázat) Ez azt mutatja, hogy mindkét triptofán oldallánc immobilis a fehérjemolekula valamennyi konformációs állapotában. Az 50-70 ns körüli érték W501+ esetén, illetve a 100 ns-nál hosszabb lecsengési idők W129+-nál (23. ábra) azt is mutatják, hogy az előbbi oldallánc emissziós dipólusa az ellipszoid alakú motor domén rövid, míg az utóbbié a hosszú tengelye mentén helyezkedik el. 5.27 A spektrális változások értelmezése a szerkezeti adatok fényében A miozin ATP-áz működés során két lépésben – a nukleotid kötésekor és az ATPhidrolízissel egyidejűleg – történő triptofán fluoreszcencia-változások közül az utóbbi a konvencionális miozinokban egyöntetűen a konzervatív relé-hurok triptofánhoz rendelhető, míg a kötéskor bekövetkező változás

összetettebb, kevésbé konzervatív sajátságok eredményeképpen jön létre. 5.271 A kötéskor bekövetkező fluoreszcencia-változások eredete A W113+ fluoreszcencia 3-5 %-os emelkedése a W131+ 30 %-os csökkenése mellett (figyelembe véve, hogy relatív fluoreszcencia-intenzitásuk apo állapotban IW113+/IW131+ = 1/0,63) 50 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése nem szolgáltat egyszerű magyarázatot a nyúl vázizom miozinban (és más izoformákban, pl. simaizom miozinban) a kötéskor megfigyelhető kis mértékű emelkedésre. A vázizom W131 fluoreszcenciájának a kötéskor megfigyelhető változását ezen oldallánc helyspecifikus kémiai módosításával való kioltása révén vizsgálták (89). Ezek a kísérletek a W131 emisszió 20 %-os emelkedését mutatták. (A Dictyostelium miozinnal kapott eredményeinkkel összhangban a vázizom W131 fluoreszcencia sem volt érzékeny a nyitott-zárt

átalakulásra.) A kötőzsebnél elhelyezkedő triptofánok mellett a konzervatív relé-hurok triptofán (Dictyostelium W501, vázizom W510, simaizom W512) is hozzájárul a kötéskor tapasztalható fluoreszcencia-változáshoz: Dictyostelium miozinban –15-20 % (80), vázizom miozinban +38 % (89), simaizom miozinban +30 % változást mutat (90). Jelenlegi ismereteink alapján ezért a kötéskor bekövetkező fluoreszcencia-változás nem rendelhető egyértelműen a miozin fej egy adott triptofán oldalláncához. Az adatokból ehelyett az alábbi következtetéseket lehet levonni: (a) A kötéssel egyidejű változáshoz mind a kötőhelynél lévő triptofán(ok), mind a relé-hurok triptofán hozzájárul; (b) Az egyes triptofán oldalláncok által mutatott fluoreszcencia-változás irányát és mértékét az oldalláncok nem-konzervatív környezete határozza meg; (c) A különböző fajokból származó vizsgált miozinoknál a kötés kinetikai sajátságai és

funkcionális következményei igen hasonlóak, ezért ezek az ortológok minden bizonnyal hasonló globális konformáció-változásokon mennek keresztül a nukleotid-kötés során. Az egyes triptofán oldalláncok lokális mozgásai is hasonlóak lehetnek a különböző miozinokban, az eltérő fehérjekörnyezet miatt azonban különbözik ezeknek a szerkezeti változásoknak a triptofánok fluoreszcens tulajdonságaira gyakorolt hatása. A fentieken kívül más triptofánok (pl. a konzervatív W432 Dictyostelium miozinban, W440 vázizom miozinban) valószínűleg nem járulnak hozzá a fluoreszcencia-változásokhoz, mivel a W501F és W501Y Dictyostelium mutánsok nem mutattak jelváltozást sem a nukleotid kötésekor, sem a hidrolíziskor ((80, 91), 14. ábra) 5.272 Konformációs „szubállapotok” a szenzorok környezetében A különböző kémiai környezetekben elhelyezkedő triptofán oldalláncok steady-state és időfelbontott fluoreszcens tulajdonságait a

fluorofórnak a kioltó sajátságokkal rendelkező molekulákkal, csoportokkal létesített kölcsönhatásai határozzák meg. A szabad triptofán rotamerjeiben elsősorban a molekula amino- illetve karboxilcsoportja és az indolgyűrű közötti ilyen kölcsönhatások jelentősek. A fehérjekörnyezetben elhelyezkedő triptofán az oldószerből 51 Doktori értekezés érkező molekulákon (H2O, O2) kívül kioltó kölcsönhatásba léphet más aminosavak oldalláncaival is. A töltött oldalláncok (Lys, Glu, Asp) mellett egyéb csoportok (Gln, Asn, His, Cys, peptidgerinc karbonil) is jelentős kioltó hatással rendelkeznek. A különböző dinamikus kioltó hatások változó mértékben csökkentik a fluorofórok életidejét, ezért az a fehérje-triptofánok esetén széles tartományban (0,1-10 ns) mozog. Egy-triptofános motor domén konstrukcióink három emisszió-komponensét (statikusan kioltott, 1 ns-os illetve 5 ns-os) a fehérjemolekulának az egyes globális

konformáció-állapotokon belül a triptofán oldallánc környezete alapján megkülönböztethető három „szubállapotával” hozhatjuk összefüggésbe. Szubállapotok alatt itt az enzim olyan konformáció-állapotait értjük, amelyek a ligandumkötéssel illetve ATP-hidrolízissel együtt járó nagyobb konformációs átmenetekhez képest gyors egyensúlyban vannak (24. ábra) Ezen átmenetek a triptofán emisszió életidő-komponenseinél (mivel azok világosan szétválnak a lecsengésekben) szükségszerűen lassabb, illetve a relaxációs technikák felbontóképességénél (mivel azokkal nem detektáltunk a globális konformációs átmeneteknél gyorsabb változásokat, lásd 5.44 - 545 fejezetek) gyorsabb időskálán játszódnak le (5 ns – 20 µs). Az egyes szubállapotok egyrészt adódhatnak a vizsgált triptofán oldallánc különböző konformációiból (rotamerek), amelyeknek egymásba alakulása szabad triptofán esetében is az

életidő-komponenseknél lassabban (>60 ns) zajlik. Másrészt a környező szerkezeti elemek, oldalláncok mobilitása is okozhatja kioltó kölcsönhatások megváltozását. A W501 oldalláncra a motor zárt állapotában (a MgADPVi komplex 24. ábra: A W501+ konformációs szubállapotainak egyensúlya és kapcsolata a molekula globális konformációállapotaival M0: statikusan kioltott, M1: 1 ns-os, M5: 5 ns-os életidő-komponens. A komponensek mellett egyensúlyi részarányukat tüntettem fel. 52 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése kristályszerkezete alapján) a relé-hélix és -hurok (Gln491, Tyr494, Trp501 karbonil, Thr502 karbonil), valamint a konverter régió (Lys690 karbonil és ε-aminocsoportja) egyes aminosavai bírhatnak kioltó hatással térbeli közelségük (<0,5 nm) révén. A fentiek miatt nem meglepő, hogy a vizsgált egy-triptofános fehérjék fluoreszcenciaemissziója több

komponensből tevődik össze. Annál érdekesebb viszont az a tény, hogy az emisszió-komponensek hasonló életidejűek, egyrészt egy adott fehérje különböző globális konformáció-állapotaiban, másrészt a triptofánt különböző pozíciókban tartalmazó mutánsokban is16. Ez a megfigyelés arra enged következtetni, hogy az egyes pozíciókban, illetve állapotokban a triptofán szenzor által létesített különböző kölcsönhatások „súlyozása” (vagyis relatív élettartama) eltérő, jellegük azonban nem. Ezek a kölcsönhatások így a triptofán fluoreszcencia-életidőre gyakorolt hatásuk alapján csoportosíthatók. Park és Burghardt (95) a vázizom miozin S1 relé-hurok triptofán (W510) fluoreszcenciáját az SH1 oldallánchoz kapcsolt fluoreszceinnel történő szelektív kioltás révén izolálták a többi triptofán által okozott háttérszignáltól. Időfelbontott fluoreszcencia-vizsgálataik azt mutatták, hogy az egykomponensű W510

emisszió életideje nem különbözik jelentősen az egyes konformációs állapotokban (7-9 ns). Az ATP-indukált intenzitás-növekedést elsősorban a W510re gyakorolt statikus kioltó hatás csökkenése okozza, amit az Y503 (Dictyostelium miozinban Y494) oldalláncnak tulajdonítanak. Eredményeik összhangban vannak az általunk kimutatottakkal, nevezetesen a statikus komponens ATP okozta csökkenésével, illetve a hosszú életidejű komponens részarányának egyidejű növekedésével. Vizsgálataikban rövid életidejű komponenst nem tudtak detektálni, amit azzal magyaráznak, hogy a fluoreszcein kioltó hatása erre a komponensre vélhetőleg kevésbé érvényesült, ezért vált „láthatatlanná” a W510-kioltott fehérje intenzitásának a módosítatlanéból történő kivonásakor. 5.273 A relé-hurok „felolvadása” – statikus vagy dinamikus rendezetlenség? A relé-hurok térszerkezete a zárt miozin kristályszerkezetekben jól definiált, míg nyitott

állapotban nem volt meghatározható. Utóbbi oka lehet a régió nagyfokú mobilitása a nyitott állapotban. Ennek ellentmond a W501 próba magas steady-state anizotrópia értéke, illetve hosszú anizotrópia-lecsengési ideje, amely tulajdonságok valamennyi globális konformáció-állapotban hasonlók. A fenti kristályszerkezeti megfigyelések oka így a relé-hurok statikus rendezetlenségében keresendő. Shih és Spudich (96) Dictyostelium miozinon végzett keresztkötési A kapott életidők minden bizonnyal nem az intenzitás-lecsengési profilok kettős exponenciális illesztésének műtermékei, mivel az egyfázisú illesztés nem adott kielégítő eredményt, háromfázisú illesztés esetén pedig nem jelent meg újabb komponens, illetve nem javult az illeszkedés minősége a kétfázisúhoz képest. 16 53 Doktori értekezés kísérletei (499 és 738 pozíciók közötti diszulfidhíd létrehozásával) is arra utalnak, hogy a reléhurok és a

konverter régió közötti kölcsönhatási felszín nem szenved változást az enzimatikus ciklus során. A nukleotid kötőhelynél (W113, W129, W131) illetve a relé-hurokban (W501) elhelyezkedő szenzorokat tartalmazó egy-triptofános mutánsok a nagy fluoreszcencia-változások révén a konformációs átmenetek érzékeny detektálására alkalmasak. A szenzorok molekuláris dinamikája a motor domén konformációs szubállapotainak dinamikus egyensúlyára utal. 54 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése 5.3 A nukleotid-kötési folyamat érzékeny kinetikai felbontása a kötőzseb melletti triptofánt tartalmazó mutánsok segítségével Az ATP irreverzibilis kötése nagy szabadenergia-felszabadulással jár, ami az aktomiozin komplex disszociációjához szükséges. Milyen változások történnek az ismeretlen szerkezetű apo-miozin és az ismert szerkezetű nukleotid-kötött forma közötti átmenet során?

Hány lépésben akkumulálódik a kötési szabadenergia, és e lépések hogyan kapcsolódnak az aktomiozin disszociációjához? 5.31 Háttér A miozin nukleotid-kötése energetikai szempontból kiemelkedő fontosságú folyamat, mivel e lépés(sorozat) során szabadul fel az aktomiozin komplex disszociációjához szükséges szabadenergia. A vázizom miozin S1 nem-hidrolizálható nukleotidok kötésekor fluoreszcenciaemelkedést mutat, hidrolizálható nukleotidok esetén pedig további emelkedés tapasztalható (61) Ez arra utal, hogy két külön lépésben történik fluoreszcencia-változás a kötés (gyorsabb fázis) illetve a hidrolízis (lassabb fázis) során (2.311 fejezet, 1 séma) A kötéssel együtt járó fluoreszcencia-emelkedés megfigyelt sebességi állandója platót mutat (20oC-on 400 s–1 körüli értéknél), ami arra utal, hogy maga a kötési folyamat is legalább két lépésből áll: a másodrendű ütközési lépést egy (ATP esetén

irreverzibilis) izomerizáció követi, amely limitálja a fluoreszcencia-változás sebességét nagy nukleotid-koncentrációk esetén (3. séma) A kötési folyamat érzékenyebb felbontása a fluoreszcencia-változás kis amplitúdója (5-10 %), valamint a hidrolízissel együtt járó további fluoreszcencia-emelkedési fázis miatt nem volt lehetséges. 1 M + ADP 2 M.ADP M*.ADP 3. séma A relé-hurok triptofánt tartalmazó W501+ Dictyostelium motor domén mutáns nukleotidkötésre 10-20 % fluoreszcencia-csökkenést mutat, amelynek sebességi állandója 250 s–1 felett éri el maximumát (80). Jóllehet ennél az egy-triptofános mutánsnál a többi, nem-érzékeny triptofán hiánya miatt nincs a változás amplitúdóját csökkentő fluoreszcencia-háttér, a rákövetkező hidrolízis-lépéshez kapcsolódó nagy emelkedés megnehezíti a kötési tranziensek pontos elemzését. 55 Doktori értekezés A nukleotid-kötési lépések nagyfelbontású tranziens

kinetikai vizsgálatához alkalmazott kísérleti megközelítésünk ebben a kérdéskörben először kombinálta a rekombináns DNS technikákon alapuló fehérjetervezés (protein engineering) adta lehetőségeket a modern gyorskinetikai mérőműszerek felbontóképességének maximális kihasználásával. Ezekhez a kísérletekhez a fentebb már leírt W113+, W129+ és W131+ egy-triptofános mutánsokat használtuk. A folyamatok érzékeny detektálását a következők tették lehetővé: (a) Egy-triptofános mutánsaink a nem szenzitív triptofánok okozta fluoreszcencia-háttér kiküszöbölése révén jóval nagyobb fluoreszcencia-változásokat mutatnak a nukleotid kötésére (akár 55 %), mint a vad típusú enzim (5-10 %), ezzel lényegesen jobb jel-zaj arány elérését teszik lehetővé; (b) Ezen mutánsok fluoreszcenciája – a természetes enzimmel ellentétben – nem érzékeny az ATP-áz ciklus egyéb lépéseire (pl. a hidrolízis-lépéshez kapcsolt

nyitott-zárt konformációs átmenetre), így rajtuk a nukleotid-kötés folyamata „izoláltan” tanulmányozható; (c) Az általunk használt megállított áramlásos műszerrel 0,5 ms-ra sikerült redukálni a mérés holtidejét, ami jelentősen alacsonyabb, mint a korábbi vizsgálatok esetében (1,5-2 ms), így a kezdeti gyors (> 500 s–1) folyamatok is felbonthatóvá váltak; (d) A logaritmikus időbeosztású mintavételezés segítségével a többlépéses folyamat valamennyi fázisáról elegendő adatpontot tudtunk gyűjteni az analízishez, ezzel kiküszöbölve az analíziskor a különböző sebességű fázisok eltérő súlyozásából adódó műtermékeket (97). A vizsgált mutánsok a vad típusú motor doménéhez hasonló steady-state ATP-áz aktivitással rendelkeztek. A vad típusú fehérje bazális ATP-áz aktivitása 0,07 ± 0,01 s–1 (80), míg W129+ esetén 0,036 ± 0,004 s–1, illetve W131+ -nál 0,080 ± 0,010 volt. Korábbi vizsgálatok során

is tapasztalható volt, hogy a konzervatív W501 aminosav fenilalaninra cserélése némileg módosítja a bazális ATP-áz aktivitást (80), jóllehet a W501Y-2R konstrukció, amely mesterséges α-aktinin erőkart is tartalmaz, a vad típusúval megegyező aktivitást mutatott (91). A tranziens kinetikai vizsgálatokból (5.32 - 5.34 fejezetek) azonban kitűnik, hogy az enzimműködés mechanizmusában a mutációk nem okoztak változást. 5.32 A ligandum-kötési lépések tranziens kinetikai vizsgálata A W129+ mutáns mutatta a legnagyobb steady-state fluoreszcencia-jelváltozást nukleotid-kötés hatására (55 %, lásd 5.231 fejezet), ezért a folyamatot legrészletesebben ezen a fehérjén tanulmányoztuk. Az ADP-kötés 20oC-on, pszeudo-elsőrendű körülmények között felvett megállított áramlásos tranziensei a teljes vizsgált ADP koncentráció-tartományban (20-1000 µM) 56 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai

megközelítése a) 50 2 µM W129+ x ADP 40 Amplitúdó (%) Fluoreszcencia 1.0 b) 20 µM 0.8 120 µM 0.6 30 20 10 400 µM 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0 0 0.05 200 Idõ (s) c) 400 600 800 [ADP] (µM) 1500 d) 150 -1 kobs (s-1) -1 kobs (s ) 1000 Gyors fázis kísérleti szimulált 500 0 0 200 400 600 [ADP] (µM) 800 100 Lassú fázis kísérleti szimulált 50 0 0 200 400 600 800 [ADP] (µM) 25. ábra: a) A W129+ motor domén ADP-vel történő reakciójának néhány reprezentatív megállított áramlásos görbéje b) A kapott tranziensek gyors és lassú fázisai relatív amplitúdóinak nukleotid-koncentrációfüggése c) A gyors fázis megfigyelt sebességi állandóinak nukleotid-koncentrációfüggése d) A lassú fázis megfigyelt sebességi állandóinak nukleotid-koncentrációfüggése A szimuláció alapjául szolgáló modell paramétereit lásd a szövegben. Narancsszínnel a gyors, kékkel a lassú fázis adatait tüntettem

fel. A világosszürke szimbólumok azokat a pontokat jelzik, ahol a kis amplitúdó miatt a sebességi állandó értéke bizonytalan. kétfázisúak voltak, jóllehet a kétfázisúság a skála közepén (100-200 µM) volt igazán kifejezett (25a-b ábra). A tranziensekhez ezért kétfázisú exponenciális függvényeket illesztettünk, amelyek elsősorban a koncentráció-tartomány közepén jelentettek jelentős javulást az egyfázisú illesztéshez képest. A 25b-d ábrákon látható a kapott gyors és lassú fázisok megfigyelt sebességi állandójának (kobs) és amplitúdójának ADP koncentrációfüggése17. A gyors fázis nagy (>500 s–1) y- Mivel a reakció gyors fázisának jelentős része lezajlik a holtidő alatt (pl. egy 1000 s–1 sebességi állandójú reakció 40 %-a végbemegy 0,5 ms alatt), ellenőriztük azt is, hogy ez mennyiben befolyásolja a kapott megfigyelt sebességi állandókat. A kísérleti tranzienseket két módon analizáltuk Az egyik

megközelítésben az illesztett exponenciális görbéket a reakció kalkulált kezdőpontjáig extrapoláltuk. (A 12b-d ábrák így nyert kobs és amplitúdó-adatokat tartalmaznak.) Másrészt elvégeztük az analízist úgy is, hogy az illesztett görbének csak a holtidő letelte utáni pontjait vettük számításba. A megfigyelt sebességi állandók koncentráció-profilja igen hasonló volt a két esetben, valamint az eltérés csekély volt a két módon kapott kobs értékek között. A kezdőpontra extrapolált illesztések teljes amplitúdója jól követte az 1-10 µM nagyságrendbe eső Kd-jű ADP-kötés profilját. Annak a lehetőségét is meg kellett vizsgálni, hogy a reakciónak van az első detektálható fázisnál gyorsabb fluoreszcencia-változással járó fázisa is. Ez azért zárható ki, mert a számított holtidő alapján a megfigyelt 17 57 Doktori értekezés tengelymetszetet és kis meredekséget (<1 µM–1s–1) mutatott, míg a

lassú fázis koncentrációfüggésének hiperbolikus illesztése 200 s–1 alatti telítési értéket eredményezett, amely fél-maximumát 100 µM alatti ADP-koncentrációnál érte el (25c-d ábra). A gyors fázis amplitúdója alacsony ADP-koncentrációknál alacsony volt (25b ábra), ezért tengelymetszete bizonytalan, míg a lassú fázis amplitúdója magas ADP-koncentrációknál volt alacsony (a teljes változás kb. 20 %ához tartott) A kétfázisú lecsengések a vázizom miozin nukleotid-kötési folyamatára korábban felállított modellel ((61), 2.311 fejezet) nem egyeztethetők össze, mivel az egyfázisú tranzienseket eredményez. A legegyszerűbb reakcióséma, amely a kapotthoz hasonló profilt mutathat, egy másodrendű, fluoreszcencia-változással járó kezdeti lépésből és egy ezt követő izomerizációból áll (4. séma) 1 M + ADP 2 † M 1.ADP M†2.ADP 4. séma Ebben az esetben a csökkenés gyors fázisa az 1. lépéshez rendelhető (kobs

(gyors) = k+1[ADP] + k–1). A lassú fázis abból adódik, hogy a 2 lépés a gyors 1 egyensúly kialakulását követően „elvonja” az M†1.ADP komponenst Megfigyelt sebességi állandója ezért ezen komponens koncentrációjától függ, és így a K1 egyensúlyra jellemző telítést mutat (kobs (lassú) = k+2{K1[ADP]/(1+K1[ADP])}+k–2), és az ADP-koncentráció növelésével k+2-höz tart (a k–2 tag nem jelentős, mivel a 2. egyensúly ADP-ben is erősen jobbra van eltolva) Ha a 2 lépésben nem történik további fluoreszcencia-csökkenés (FM†1.ADP = FM†2ADP), akkor a lassú fázis amplitúdója az 1. lépés telítődésének megfelelően 0-hoz fog tartani; ellenkező esetben nagy ADPkoncentrációknál a két fázis amplitúdójának aránya az egyes lépések során bekövetkező intenzitás-változások arányát tükrözi. Ebben a modellben mind kobs , mind kobs (gyors) (lassú) koncentráció-profiljában tükröződnie kell a K1 egyensúlyi

állandónak: amikor [ADP] = Kd1, akkor kobs (gyors) kétszerese az y-tengelymetszetnek (k+1[ADP] = k–1), illetve kobs (lassú) fél-maximális értéket mutat (K1[ADP] = 1)18. A kapott koncentrációfüggések azonban kobs (gyors) lineáris illesztésével 500 µM-nál nagyobb Kd1 értékre utalnak (vö. 25c ábra), ami nem egyeztethető össze kobs (lassú) 100 µM fázisokból 0 időpontra extrapolált fluoreszcencia-szint megegyezett azzal, amit a W129+ motor domén nukleotidot nem tartalmazó pufferrel történő összekeverésekor kaptunk. 18 A modell tartalmazza azt a feltételezést is, hogy az 1. lépés gyors egyensúly (k >> k ) Szimulációkat –1 +2 végeztünk olyan esetekre, ahol a két sebességi állandó egy nagyságrendbe esik, és azt kaptuk, hogy ilyen 58 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése alatti fél-telítődésével. Ezzel a kétlépéses modellel tehát nem magyarázhatók meg a kapott

tranziensek. A gyors fázis alacsony ADP-koncentrációknál tapasztalható kis amplitúdója miatt a kobs (gyors) értékek csak bizonytalanul határozhatók meg a 20-100 µM tartományban (25c ábra). Ezért elképzelhető, hogy kobs -hoz hasonlóan kobs (lassú) (gyors) is 0-hoz közeli értékhez tart az ADP- koncentráció csökkenésével. Trybus és Taylor (63) hasonló koncentráció-profilokról számolnak be nukleotid-kötési kísérleteik alapján, amit háromlépéses (két konszekutív izomerizációt tartalmazó) modell alapján értelmeznek. Ennek a W129+ fluoreszcencia-változásaira alkalmazott változata az 5. séma szerint írható fel19 1 M + ADP 2a M.ADP 2b M†1.ADP M†2.ADP 5. séma Ebben a modellben a 2a lépésnek szükségszerűen gyorsabbnak kell lennie, mint a 2b-nek (k+2a+k–2a > k+2b+k–2b), mivel ellenkező esetben nem lenne gyors fázis a tranziensekben (a 2b lépés gyorskeveréses technikával „láthatatlan lenne”). kobs (gyors)

koncentrációfüggése viszont, ha y- tengelymetszetét 0-hoz közeli értékre rögzítjük, nagy affinitású első lépésre utal, ami nem egyeztethető össze a lassú fázis megfigyelt sebességi állandójának koncentrációfüggésével. A kapott tranziensek tehát nem magyarázhatók olyan modell alapján, amelyben egyetlen közös másodrendű lépés található. Az 5 sémán látható mechanizmust ezért kiegészítettük egy további, az 1. lépéssel párhuzamos másodrendű asszociációs lépéssel (1’ lépés, 6 séma) Ez a séma így tartalmaz egy másik, az előzővel átfedő, kompetitív kötőhelyet is. esetekben sem torzul számottevően a két fázis megfigyelt sebességi állandójának koncentrációfüggése közötti összefüggés. 19 A Bagshaw-Trentham modell (61, 66, 98) a kötési izomerizációt 2. lépésként, az ATP-hidrolízist 3 lépésként jelöli. Az összehasonlíthatóság érdekében ezért a kötési modell két konszekutív

izomerizációs lépését 2a-val illetve 2b-vel jelöltük. Talán nem felesleges ismét megjegyezni, hogy a kinetikai állapotokat jelölő szimbólumok a fluoreszcenciaváltozás irányát tükrözik, így ugyanaz a köztiállapot más jelet kaphat a különböző mutánsokban. A W129+ mutáns kapcsán szereplő M†2 komponens például megfelel a W501+ motor domén M† és M* (nyitott és zárt) állapotú komponensei összességének, mivel a W129 szenzor ez utóbbi két konformációt nem különbözteti meg. 59 Doktori értekezés 1 M + ADP 2a M†1.ADP M.ADP 1’ 2b M†2.ADP M††.ADP 6. séma A 6. séma alapján szimulált fluoreszcencia-tranziensek háromfázisú lefutást mutattak, a három fázis azonban csak közepes (100-200 µM) ADP-koncentrációknál vált egyértelműen szétválaszthatóvá, és a háromfázisú illesztés ez esetben sem jelentett jelentős javulást a kétfázisúhoz képest. Ilyen bonyolultságú séma esetén még a zajmentes

szimulált adatok analízisével sem lehetséges egyedi megoldást találni. Tovább bonyolítja az analízist az a tény, hogy az egyes komponensek fluoreszcencia-intenzitása nem ismert (azt tudjuk csak, hogy a végállapot fluoreszcenciája kb. 50 %-a az apo állapoténak) Az állapotokhoz rendelt fluoreszcencia-értékek kovarianciát mutatnak a kapott sebességi állandókkal. Mindazonáltal a kapott kísérleti görbék fázisainak megfigyelt sebességi állandói és amplitúdói jól reprodukálhatók a 7. séma szerinti sebességi állandók alapján végzett szimulációval, amint az a 25b-d ábrákból is kitűnik. 1 M + ADP 2µM–1s–1 1’ 2a 10 µM–1s–1 1300 s–1 700 s–1 M.ADP 2b 500 s–1 50 s–1 M†1.ADP 140 s–1 10 s–1 M†2.ADP ? M††.ADP 7. séma Az egyes komponensekhez a következő relatív fluoreszcencia-intenzitásokat rendeltük: FM = FM.ADP = 1; FM†1ADP = FM†2ADP = 0,5 (ADP-telített állapot fluoreszcenciája

egyensúlyban); FM††ADP = 0 (teljes kioltás). Az így szimulált tranziensek kétfázisú exponenciális illesztésével a 25b-d ábrákon látható sebességi és amplitúdó-adatokat kaptuk. Alacsony ADP-koncentrációknál a kis amplitúdójú gyors fázis az M††.ATP komponens kis arányú képződéséhez rendelhető (k–1’ gyors, ezért a gyors fázis y-tengelymetszete magas), míg a domináns lassú fázis a 2a lépéssel függ össze. 60 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése Magas ATP-koncentrációnál a 2a lépés sebessége telítődik (Kd1 = 130 µM, maximális kobs (2a) > 500 s–1), és így ez a fázis egybeolvad a kis meredekségű (k+1’ = 2 µM–1s–1) 1’ lépés okozta fluoreszcencia-csökkenési fázissal; így válik „láthatóvá” a 2b átmenet, amely a 150-200 s–1 körüli lassú fázist adja ilyen körülmények között. Közepes (100-200 µM) ADP-koncentrációknál, ahol a

három fázis sebessége leginkább szétválik, a kétfázisú illesztés a gyors fázis sebességének alá-, míg a lassú fázis sebességének felülbecslését okozza. Azonban, amint azt már említettük, a háromfázisú illesztés nem eredményez jelentős javulást, illetve a fázisok megfigyelt sebességi állandóinak gyenge szétválása miatt nem szolgáltat pontosabb információt a folyamatról. Az „egyenes” kötési útvonalon kívüli M††.ATP komponens nem megfelelő orientációban kötött nukleotidot tartalmazó állapotként értelmezhető, amelyből az erős kötés a ligandum újrakötődése (M††.ATP M + ATP MATP) vagy direkt reorientációja (M††ATP MATP) révén alakulhat ki. Az utóbbi eseménynek megfelelő direkt lépést a 7 sémán „?”-lel jelöltük, mivel – ha az 1 illetve 1’ lépéseknél gyorsabb folyamatról van szó – a kinetikai sémához való hozzáadása illetve elvonása a kapott tranzienseket nem befolyásolja.

5.33 A kötési modell megerősítése más nukleotidokkal és szenzorokkal A W129+ mutáns 5oC-on felvett ADP-kötési tranziensei lényegében a 20oC-os adatokkal megegyező sajátságokat mutattak a sebességi és amplitúdó-adatokban megfigyelhető tendenciák terén. A gyorsabb lépések eredményeként megjelenő első fázis nem volt hőmérsékletfüggő, míg a lassú fázis (2b lépés) maximális megfigyelt sebességi állandója körülbelül fele volt a 20oC-on mért értéknek (80 s–1). ATP kötésekor szintén hasonló profilokat kaptunk Ez esetben a gyors fázis ytengelymetszete (1100 s–1) és a lassú fázis maximális megfigyelt sebességi állandója (350 s–1) magasabb volt az ADP-kötésre jellemző értékeknél. A kötőzsebben található másik szenzorral (W131+) is hasonló értékeket mutató tranzienseket detektáltunk, bár a kisebb jelváltozás (25-30 %), és ennélfogva rosszabb jel-zaj arány miatt a fázisok kevésbé voltak tisztán

szétválaszthatók. A W113+ mutáns kötési tranzienseinél az igen kis amplitúdó (3-5 %) miatt nem lehetett kétfázisú illesztést alkalmazni, azonban az egyfázisú illesztés sebességi állandójának koncentrációfüggése alacsony nukleotid-koncentrációknál (meredekség: 1,3 . 106 M–1s–1) igen hasonló volt ahhoz, ami a W129+ illetve W131+ adatok egyfázisú illesztésével kapható. (A telítési érték ez esetben a nagy nukleotid-koncentrációknál jelentkező igen jelentős amplitúdóvesztés miatt nem volt meghatározható.) Itt jegyezzük meg, hogy korábbi munkákban (80) a W501+ mutáns ADP-kötésekor kapott csökkenés is az előbbiekhez hasonló profilt mutatott, 400 s–1 körüli telítési értékkel. Mindezek alapján valószínűsíthető, hogy a motor domén 61 Doktori értekezés különböző régióiban elhelyezkedő triptofánok a kötési folyamatnak ugyanazokat az eseményeit érzékelik, a jelváltozások különbözősége miatt

azonban az egyes lépések felbonthatósága eltérő. Az apo konformációból a nukleotidot erősen kötő állapotba történő átmenet során modellünk szerint tehát több lépésben történik a szabadenergia akkumulációja. A motor domén különböző pontjain elhelyezett valamennyi szenzor (W113, W129, W131, W501) fluoreszcencia-változást mutat ezekre az izomerizációs lépésekre, ami azt jelzi, hogy a nukleotid kötése a fej jelentős konformáció-változásával jár, amely az aktív helytől egészen a relé-konverter régióig terjed. 5.34 A kötőzseb-triptofán valóban csak a kötési lépésekre érzékeny Azt, hogy a W129 oldallánc (és a másik 2 µM W129+/W501+ x 20 µM ATP Fluoreszcencia 1.1 két kötőzseb-szenzor) fluoreszcencia-változása valóban csak a A B nukleotid-kötési bekövetkező 1.0 folyamat szerkezeti során változások eredménye, a W129+/W501+ kéttriptofános 0.9 vizsgálatával 0.8 -4 10 10 -3 10 -2 10 -1 10 0

10 1 Idõ (s) 26. ábra: A W129+/W501+ mutáns ATP-vel történő reakciójának lefutása A: a reakció számított kezdőpontja, B: a megfigyelés kezdőpontja (4.7 fejezet) mutáns a mutáns is W129 igazoltuk. triptofán kinetikai Utóbbi mellett tartalmazza a konzervatív relé-hurok triptofánt is, amely a kötési lépésekre 15-20 %-os fluoreszcencia-csökkenést, a nyitott-zárt átmenetre pedig 80-100 %-os növekedést mutat (80). A W129+/W501+ motor domén steady-state fluoreszcencia-változásainak nagysága (figyelembe véve a két oldallánc relatív intenzitását) a W129+ és W501+ fluoreszcenciaintenzitások additivitására utal (3. táblázat), ami nem meglepő, tekintve, hogy a két oldallánc egymástól kb. 3 nm-re helyezkedik el a kristályszerkezetekben (34), ezért hatékony energiatranszfer közöttük nem jön létre (fehérjékben a Trp-Trp pár jellemző Förster távolsága 0,4-1,6 nm közötti értékeket mutat (84)). Az additivitás egyébiránt

arról is tanúskodik, hogy a bevitt mutációk nem okoznak jelentős szerkezeti változásokat a triptofánok környezetében. A W129+/W501+ ATP-vel kapott megállított áramlásos tranziensei egy nagy, kezdeti gyors csökkenéssel járó fázis után egy lassabb, nagy fluoreszcencia-emelkedést mutatnak (26. ábra) A kezdeti gyors csökkenést a W129 oldalláncnak a kötéskor bekövetkező fluoreszcencia-csökkenése okozza Erre egyrészt sebességi paraméterei utalnak (27. ábra), illetve az, hogy a W501 oldallánc a gyors 3a egyensúly miatt nem mutat kezdeti csökkenést 20oC-on ((80), lásd még 5.43 fejezet) A 62 10 400 8 300 6 -1 kobs (s ) 500 -1 kobs (s ) Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése 200 100 4 2 2. fázis (emelkedés) 1. fázis (csökkenés) 0 0 200 400 600 [ATP] (µM) 27. ábra: A W129+/W501+ x ATP tranziensek gyors fluoreszcencia-csökkenési fázisának megfigyelt sebességi állandói

0 0 200 400 600 [ATP] (µM) 28. ábra: A W129+/W501+ x ATP tranziensek lassú fluoreszcencia-emelkedési fázisának megfigyelt sebességi állandói lassú fluoreszcencia-emelkedési fázis 8 s–1 körüli maximális értékhez tartott (28. ábra) Ez a fázis az ATP-hidrolízishez kapcsolható, sebessége pedig azt jelzi, hogy ez a lépés a W129+/W501+ esetén némileg lassabb a vad típusú enzimhez képest, ahol ez az érték 30 s–1 (80). A W129+/W501+ motor domén steady-state ATP-áz aktivitása a vad típusú enziméhez igen hasonló (0,047 ± 0,06 s–1). 5.35 A kötési lépések és az aktomiozin disszociáció kapcsolata A W129+ mutáns vizsgálata azzal az előnnyel is jár, hogy a nagy fluoreszcencia-változás révén az események aktin jelenlétében is vizsgálhatók, ahol az aktin triptofán-fluoreszcencia és az oldat fényszórása jelentős háttérszignált ad. Az aktomiozin komplex disszociációja nukleotid-kötés hatására következik be. A

folyamat leírásában ezért kiemelkedő jelenséggel bír a detektált kötési lépéseknek az aktomiozin disszociációval való kapcsolata. Előzetes kísérleti eredmények azt mutatják, hogy az akto-W129+ komplex ATP hatására 150 s–1 maximális megfigyelt sebességi állandó körül disszociál. (A vad típusú Dictyostelium motor doménnel hasonló eredményeket kaptak (65, 87).) Ezek szerint az aktomiozin komplex disszociációja a nukleotid-kötés során detektált második izomerizációs lépéssel (2b) egyidejűleg történik. Ez azt jelzi, hogy az ATPkötési folyamat irreverzibilitása a 2b lépésből adódik20 Mivel a W129+ mutáns nem érzékeny a Mivel „balra” tartó irányban a sebességi állandók (k–2a, k–2b) értéke igen alacsony, a megállított áramlásos görbékből nem nyerhető róluk pontos információ (kobs-ot legnagyobbrészt K1, k+2a illetve k+2b határozzák meg). Emiatt a nukleotid-kötési kísérletekkel nem kaphatunk közvetlen

információt arról, hogy melyik izomerizációs lépésből adódik a kötés irreverzibilitása illetve az ATP- illetve ADP-affinitás közötti több nagyságrendnyi különbség (előbbi esetben Kd ≈ 10 nM, utóbbi esetben Kd ≈ 10 µM). 20 63 Doktori értekezés hidrolízishez kapcsolt nyitott-zárt átmenetre, a 2b lépésnél lassabb fluoreszcencia-változás e kísérletekben nem detektálható, eltérően a vázizom miozintól (99). A nukleotid-kötési lépésekre szelektíven érzékeny szenzorok segítségével két konszekutív, szabadenergia-felszabadulással járó izomerizációs lépést detektáltunk a kötési folyamatban, amelynek során jelentős konformáció-változás történik. Az aktomiozin disszociáció a második izomerizációs lépéshez kapcsolódik. Kísérleteinkkel láthatóvá tettünk egy, a nukleotidot gyengén (nem megfelelő orientációban) kötő állapotot is az indukált illeszkedési folyamatban. 64 Lépésről lépésre –

egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése 5.4 A nyitott-zárt konformációs átmenet és az ATP-hidrolízis lépés kinetikai szétválasztása és kapcsoltságának vizsgálata A nyitott-zárt konformáció-változásnak, amely valószínűleg az erőkar mozgásával is jár, nem volt ismert az ATP-hidrolízissel való kapcsolata. Szétválasztható-e kinetikailag a két lépés egymástól és ha igen, milyen kapcsoltság áll fenn közöttük, azaz milyen összefüggés van az aktívhely történései és a miozin fej elmozdulása között? 5.41 Előzetes megfontolások A korábbi kinetikai vizsgálatok során a triptofán fluoreszcencia-emelkedés második fázisa mindig az ATP hidrolízisével együtt jelentkezett (3. lépés a Bagshaw-Trentham modellben, lásd 1 séma). Több jel mutatott azonban arra, hogy a konformációs átmenet (vélhetőleg e lépés jár a relé-hurok triptofán fluoreszcenciájának megváltozásával) és a hidrolízis két

külön lépésben történik (8. séma): (a) A kristályszerkezetek tanúsága szerint a nyitott konformáció nem katalizálja a hidrolízist (33, 46), ezért annak megtörténéséhez a fehérjének először át kell mennie a nyitott-zárt konformációs átalakuláson; (b) Korábbi vizsgálatok (80) kimutatták, hogy a konformációs átmenet megtörténik nemhidrolizálható ATP-analógok (AMP.PNP, ADPBeFx) jelenlétében is; (c) A Dictyostelium miozin switch-II hurok mutagenezisével olyan mutációkat vittek be a fehérjébe, amelyek a konformációs átmenetet (G457A) illetve a hidrolízis-lépést (E459A) szelektíven gátolták (47). 3a 3b M†.ATP M*.ATP M*.ADPPi nyitott zárt zárt 8. séma21 A W501+ Dictyostelium miozin motor domén mutáns fluoreszcencia-változásai eltérnek a vázizom miozinétól, ezért az ATP-áz köztiállapotok jelölése is különböző a két esetben. A nyitott állapotot (vázizom miozinban M*) e helyütt M†, a zárt állapotot

(vázizom miozinban M) M jelöli (vö. 1 séma, 522 fejezet). 21 65 Doktori értekezés Geeves és Holmes (46) okfejtése szerint a hidrolízisnek gyorsan kell megtörténnie, mivel egyébként jelentős lemaradással követné csak a fluoreszcencia-változást. Az ismert volt, hogy reverzibilis (K3 = 10), kis szabadenergia-változással járó, gyors (k+3 + k–3 = 100 s–1) folyamatról van szó. Az előbbiek azt sugallják, hogy (a) k+3a értéke 100 s–1 körül, k–3b pedig 10 s–1 körül lehet, (b) az M*.ATP állapot igen instabil, mindkét irányban gyorsan bomlik le (k–3a, k+3b >>100 s–1) (Ilyen szempontból „átmeneti állapotnak” tekinthető, ez azonban nem tévesztendő össze a hidrolízis-reakció átmeneti állapotával.) A két lépés – a konformációs átmenet és a katalitikus lépés – külön-külön detektálása technikailag nem egyszerű feladat. Egy lassú lépésnek az őt követő gyors lépéstől való direkt elkülönítése

nem lehetséges. Ha az első lépés gyorsabb, mint a második, az elkülönítés relaxációs technikákkal megoldhatóvá válik abban az esetben, ha a gyors lépés reverzibilis (0,1 < K < 10) és valamilyen külső fizikai paraméter megváltoztatásával szelektíven perturbálható. A Dictyostelium miozinra vonatkozó ismeretek alapján a következő szempontok miatt esett a választásunk a relaxációs kísérletekre: (a) A W501+ egyetlen triptofánt tartalmazó mutáns fluoreszcenciája nyitott állapotban 17 %kal alacsonyabb, zárt konformációban pedig 80-100 %-kal magasabb, mint nukleotidmentes állapotban (80). Érdekes módon, az ATP-vel történő kölcsönhatása során szobahőmérsékleten a fluoreszcencia-emelkedést („hidrolízis lépés”) megelőzően nem látható átmeneti csökkenés. Ez utóbbi amiatt lenne várható, hogy a modell szerint a fehérjének át kell mennie a nyitott konformáción, mielőtt a hidrolízis megtörténik (8. séma).

Szintén nem tapasztalható a hidrolízisnél gyorsabb fluoreszcencia-emelkedési fázis (burst). Ehelyett rövid lag-fázis után indul meg az emelkedés Erre a jelenségre egy lehetséges magyarázatot kapunk, ha feltételezzük, hogy a 3a egyensúly jóval gyorsabban alakul ki, mint ahogy a 2. lépésben az izomerizáció lejátszódik (k+3a + k–3a >> k+2), illetve a katalitikus lépésnél (3b) is gyorsabb. Ez esetben a kezdeti változás mértéke és iránya a 3a lépés egyensúlyi állandójától függ. Figyelembe véve a nyitott és zárt állapotok fenti relatív fluoreszcencia-intenzitását, a kezdeti gyors változás elmaradása 0,1 és 0,5 közötti K3a értékre utal (20oC-on); (b) Az előbbiek alapján arra lehetett számítani, hogy a 3a egyensúly kialakulásának relaxációs ideje 1 ms körüli/alatti érték lesz. Ilyen gyors folyamatok vizsgálatára a hosszabb holtidejű gyorskeverési technikák nem alkalmasak, a perturbációs kísérletek

időfelbontása viszont lehetővé teszi a probléma vizsgálatát; 66 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése (c) Az AMP.PNP-vel végzett megállított áramlásos kísérletek arra mutattak, hogy a nyitott-zárt egyensúlyi állandó (K3a) viszonylag szűk hőmérsékleti tartományban (9-26oC) is jelentős hőfüggést mutat (80). A nyúl vázizom S1-en és a Dictyostelium motor domén mutánsokon (W501+, W129+) végzett kísérletek tanúsága szerint ugyanakkor a k+2 sebességi állandó hőfüggése nem jelentős (61, 80), e lépés tehát nem jelenik meg a relaxációs tranziensekben – egyébiránt azért sem, mert ez esetben az egyik irányba erősen eltolt egyensúlyról van szó. A két lépés perturbálhatóságát, illetve kapcsoltságát először steady-state fluoreszcencia, illetve megállított áramlásos kísérletekkel vizsgáltuk: (a) Egyrészt a különböző nukleotidokkal és -analógokkal komplexben

lévő motor domén steady-state fluoreszcenciájának hőfüggését vizsgáltuk meg, hogy kiderítsük: a ciklus mely lépése(i) perturbálható(k) szelektíven a hőmérséklet változtatásával. (b) Másfelől, ha az ATP-vel történő reakció során valóban a K3a egyensúlyi állandó határozza meg a kezdeti gyors változás irányát és mértékét, akkor alacsony hőmérsékleten végzett megállított áramlásos mérésekkel ez kimutatható lehet, ha az említett egyensúly hőérzékeny. 5.42 A nyitott-zárt egyensúly hőmérsékletfüggésének vizsgálata a W501+ fluoreszcencia segítségével 5.421 apo, ADP és ADPAlF4: három különböző globális konformáció A W501+ mutáns a már említett nagy szignál-változások révén az egyes konformációs állapotok érzékeny megkülönböztetésére alkalmas. A motor domén különböző nukleotidokkal illetve nukleotid- analógokkal alkotott komplexeinek konformációs egyensúlyait a W501+ fluoreszcencia

alapján 29. ábra: A W501+ steady-state fluoreszcencia hőmérsékletfüggése hőmérsékletfüggése vizsgáltuk. A triptofán fluoreszcencia a kémiai környezet megváltozásától függetlenül is 67 Doktori értekezés változik a hőmérséklettel. Ez a fizikai hatás olyan folyamatok sebességének hőmérsékletfüggéséből ered, amelyek a gerjesztett fluorofórnak az alapállapotba fotonemisszió nélkül való visszatérését okozzák, így csökkentve a gerjesztett állapot életidejét. Az effektus mértékét a NATA fluoreszcencia hőmérsékletfüggésének mérésével vizsgáltuk, és azt kaptuk, hogy mind vizes közegben, mind etanolban (utóbbival a fehérjében lévő triptofán oldallánc környezetét igyekeztünk utánozni) a hőmérséklet emelésével 1oC-onként kb. 1%-os a fluoreszcencia-csökkenés mértéke a vizsgált hőmérsékleti tartományban (3-26oC) (29. ábra) A W501+ motor domén triptofán fluoreszcenciája

nukleotid-mentes, illetve ADP-kötött állapotban a NATA-hoz hasonló meredekségű hőmérsékletfüggést mutatott. Ez arra utal, hogy ilyen körülmények között a motor domén egy homogén globális konformáció-állapotban van. (Az is elképzelhető, hogy több, azonos fluoreszcenciájú állapot közötti, vagy különböző fluoreszcenciájú állapotok közötti, ám hőmérsékletre nem érzékeny egyensúlyról van szó, a modell szempontjából azonban a legegyszerűbb egy állapotot feltételezni.) A motor domén - ADPAlF4 és ADPVi komplexek fluoreszcenciájának hőfüggése is hasonló, azonban a kb. 80%-kal magasabb intenzitás egy harmadik globális konformáció-állapotra utal (zárt). 5.422 A hőmérséklet hatása a steady-state ATP-áz köztiállapotok összetételére ATP-ben a fluoreszcencia a vizsgált hőmérsékleti tartományban szorosan követte az ADP.AlF4 komplex intenzitását Ez azt jelzi, hogy az ATP-áz reakció steady-state szakaszában egy

zárt konformációjú intermedier (M*.ADPPi) van jelen legnagyobb mennyiségben ADPAlF4-ban és ATP-ben alacsony hőmérsékleten a fluoreszcencia-hőfüggés lefutása eltért az apo és ADP állapotokban tapasztalt meredekségtől. Ennek a jelenségnek az oka nem ismert Megjegyzendő azonban, hogy egy későbbi mérés alkalmával ADP.AlF4-ban nem tapasztaltuk ezt az elhajlást (lásd 5.53 fejezet, 36a ábra), ATP-ben viszont különösen alacsony hőmérsékleten jelentősen alacsonyabb volt a fluoreszcencia-intenzitás az ADP.AlF4-ban mértnél, ami azt mutatja, hogy egy vagy több nyitott konformációjú intermedier (M†.ATP, M†ADP) is jelentős mennyiségben van jelen a steady-state szakaszban. 5.423 AMPPNP és ADPBeFx: két globális konformáció hőmérsékletfüggő egyensúlyban Az AMP.PNP és ADPBeFx komplexek fluoreszcenciája az apo, ADP és ADPAlF4 komplexekétől merőben eltérő hőfüggést mutatott (29. ábra) A változás iránya is megfordult, így a

hőmérséklet emelkedésével a fluoreszcencia-intenzitás is növekedett. Erre kézenfekvő magyarázatul szolgál, hogy ezen analógok jelenlétében a motor domén két különböző globális 68 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése konformációs állapota (nyitott és zárt) közötti egyensúly alakul ki, amelyek egyensúlyi állandója 1hez közeli érték a vizsgált hőmérsékleti tartományban, illetve az egyensúlyi állandó erősen hömérsékletfüggő: magasabb hőmérsékleten nagyobb lesz a zárt konformáció részaránya. Ezek a kísérletek arra is utaltak, hogy a hőugrásos módszer alkalmas lehet a nyitott-zárt átmenet kinetikai paramétereinek vizsgálatára. 5.424 A nyitott-zárt egyensúly termodinamikai paraméterei: egymást kompenzáló nagy entalpikus és entrópikus tagok A fluoreszcencia-értékekből a nyitott-zárt egyensúlyi állandó és ennek hőfüggéséből az egyensúly

termodinamikai paraméterei kiszámíthatók, ha az ADP állapothoz tartozó fluoreszcencia-értéket (Fo) a 100% nyitott konformációhoz, az ADP.AlF4 állapothoz (illetve annak a 20-26oC tartományból történő extrapolálásához) tartozót (Fc) pedig a 100% zárt konformációhoz rendeljük. (A hőfüggés és más korábbi vizsgálatok (80) alapján az apo állapot nem e kettő keverékének, hanem egy harmadik globális konformáció-állapotnak felel meg.) A nyitott-zárt egyensúly így kapott látszólagos egyensúlyi állandója [appKoc = (F-Fo)/(Fc-F)] az AMP.PNP és ADPBeFx komplexek esetében ténylegesen a konformációs egyensúly állandója (K3a). ATP-ben viszont a rákövetkező hidrolízis-lépés a 3a egyensúlyt jobbra „húzza el”, így az app Koc értéket a K3b egyensúlyi állandó is befolyásolja (appKoc = K3a[1+K3b]). A kapott appKoc értékek (4. táblázat) AMPPNP-ben és ADPBeFx-ban 0,1 és 2 közöttiek, így a relaxációs kísérletekhez

megfelelő tartományba esnek. ATP-ben 3 és 45 közé eső appKoc [=K3a (1+K3b)] értékeket kaptunk, ami azt jelzi, hogy ha K3a hasonló az ADP.BeFx-ban mértekhez, akkor a 3b egyensúly is reverzibilis (K3b < 100). A nyitott-zárt egyensúly standard szabadenergia-változását ∆Go = –RTlnappKoc -ból, míg a ∆Ho értékeket az egyensúlyi állandó hőmérsékletfüggésének van’t Hoff ábrázolásából (lnappKoc vs 1/T, meredekség = -∆Ho/R) számítottuk. A kapott eredmények összhangban vannak azokkal a korábbi megfigyelésekkel, amelyek szerint a hidrolízis-lépés (3a+3b), jóllehet reverzibilis, és így kis szabadenergia-változással járó folyamat (∆Go = –2,6 kJ/mol (5oC), illetve –9,4 kJ/mol (20oC)), ez a kis változás jelentős entalpikus (∆Ho = 117 kJ/mol (5oC), illetve 82 kJ/mol (20oC)) és entrópikus tagok kiegyenlítődéséből adódik (64, 100). 69 Doktori értekezés 5.43 A gyors kezdeti csökkenés kimutatása alacsony

hőmérsékleten megállított áramlásos méréssel A egyensúlyi állandó hőmérsékletfüggése arra utalt, hogy 2.0 1.8 Fluoreszcencia K3a alacsony hőmérsékleten az ATP-vel A B történő reakció során meg kell jelennie a 1.6 o hidrolízissel o emelkedés előtti átmeneti csökkenésnek. 2C 1.4 8.5 C 1.2 Megállított o 20 C 1.0 egyidejű fluoreszcencia- áramlásos mérésekkel kimutattuk, hogy 10oC alatt valóban 10 -5 10 -4 10 -3 -2 10 -1 0 10 10 megjelenik az említett tranziens (30. Idõ (s) 30. ábra: A W501+ mutáns ATP-vel történő reakciójának lefutása különböző hőmérsékleteken Koncentrációk: 2 µM W501+, 250 µM ATP. A: a reakció számított kezdőpontja, B: a megfigyelés kezdőpontja (lásd a 4.7 fejezetben) ábra), mivel itt a nyitott konformációjú intermedier (M†.ATP) mennyisége átmenetileg nagyobb lesz. A kapott görbékből így információ nyerhető mind az ATP-kötési izomerizáció

sebességi állandójára (k+2), mind a nyitott-zárt egyensúlyi állandóra (K3a), mind a hidrolízis sebességi állandójára (k+3b) vonatkozólag. Alacsony hőmérsékleten a kötési izomerizáció lassabban történik (k2 = 130 s–1 2oC-on), így jól mérhető. A fluoreszcencia-emelkedés megfigyelt sebességi állandójának (kobs = K3ak+3b + k–3b) hőmérsékletfüggéséből (Arrhenius-ábrázolás, ln kobs vs 1/T, 31. ábra) 11 kJ/mol látszólagos aktivációs energia adódik, ez azonban legalább két hőérzékeny lépést (3a és 3b) foglal magába. 25 20 15 10 5 o C 60 40 31. ábra: A hidrolízis megfigyelt sebességi állandójának Arrhenius-ábrázolása -1 kobs(s ) 20 8 6 4 2 0.0034 0.0035 1/T (1/K) 70 0.0036 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése 5.44 A konformációs átmenet kimutatása hőugrással Mivel az előző kísérletekből kitűnt, hogy a nyitott-zárt átmenet

erősen hőmérsékletfüggő, kinetikai paramétereinek meghatározásához hőugrásos relaxációs technikát alkalmaztunk. A kontrollként használt NATA-n felvett hőugrásos görbékből kitűnik, hogy a hőugrás kb. 100 µs időtartományban következett be, és mértéke a fluoreszcencia-csökkenés nagyságából kb. 10oC-ra becsülhető (kiindulási hőmérséklet: 16oC, 32. ábra) A minta hűlése kb 100 ms után volt jelentős A W501+ motor doménnel nukleotid-mentes, valamint ADP illetve ADP.Al F4-kötött állapotban végzett hasonló kísérletek során a NATA-val megegyező lecsengést kaptunk, ami azt mutatja, hogy a mintában a hőugrás hatására nem történt fluoreszcencia-változással járó átmenet. Az AMP.PNP illetve ADPBeFx komplexekkel végzett kísérletekben azonban megjelent egy, az előző mintákban nem tapasztalt, 1000 s–1 körüli megfigyelt sebességi állandójú fluoreszcenciaemelkedési fázis is, amely a nyitott-zárt átmenetnek

feleltethető meg. Erre egyrészt az utal, hogy a fluoreszcencia Relatív fluoreszcencia (%) hőfüggéses kísérletek alapján várható irányba ADP.BeFx 120 a változott (magasabb hőmérséklet a AMPPNP zárt 110 állapot felé tolja el az egyensúlyt), másrészt hogy a 2. lépés erősen jobbra van eltolva, így 100 NATA várhatólag észlelhető 90 apo -5 10 10 -4 -3 -2 10 10 Idõ (s) -1 10 0 10 32. ábra: A NATA és a W501+ motor domén hőugrásos tranziensei A NATA hőugrásos görbéjéből számított fűtési és hűlési fázisok levonása után kapott tranziensekhez egyfázisú exponenciálisokat illesztettünk (fekete vonalak AMP.PNP-ben és ADPBeFx-ban) nem perturbálható mértékben. (A BeFx komplex bekötődése a γ-foszfát kötőhelyre a kapott tranziensnél több nagyságrenddel lassabb folyamat.) A fentebb említett hűlési sebesség miatt az 50 s–1-nál lassabb folyamatok nehezen detektálhatók a hőugrásos

kísérletben. A kapott gyors fázis amplitúdója azonban megfelel a hőfüggés alapján várt változás mértékének, így kizárható, hogy a hőugrás ezekben a mintákban indukált volna lassabb, azonban a hűlés miatt nem látható átmenet(ek)et is. ATP-vel nem végeztünk hőugrásos kísérleteket, mivel ezekben a mérésekben a nem túl jó jel-zaj arány miatt legalább 50 ismétlésre volt szükség, ami a hosszú regenerálódási idő (150 s) miatt igen magas ATP-koncentráció alkalmazását követelte volna. 71 Doktori értekezés 5.45 Nyomásugrásos méréssel a nyitott-zárt átmenet és a hidrolízis közvetlenül detektálhatók A fehérjék globális konformáció-változásainál gyakori jelenség, hogy a hőérzékeny, nagy entalpia-változással járó átmenetek a szolvatációs szerkezet jelentős megváltozásával járnak együtt. Emiatt a reakció jelentős térfogat-változással jár, ami miatt egyensúlyi állandója érzékeny a nyomás

megváltozására22. Ezért a nyitott-zárt átmenet és a hozzá kapcsolt hidrolízis-lépés tanulmányozására nyomásugrásos kísérleteket is végeztünk. A nyomásugrásos módszer számos technikai előnnyel bír a hőugrásos méréssel szemben: (a) Mivel nincs a hőugrás utáni hűlési fázisnak megfelelő lassú esemény, a mérések nagy gyakorisággal (akár 12,5 Hz) ismételhetők, így lényegesen jobb jel-zaj arány érhető el; (b) Az előbbi okból a mérési adatok hosszú (több másodperces, perces) időskálán is felvehetők; (c) Az ugrás mindkét irányba végrehajtható; (d) Nem szükséges a mérési puffer ionerejét megnövelni, ami a hőugrásos kísérletnél a megfelelő elektromos és hővezetés eléréséhez szükséges; (e) A triptofán fluoreszcencia az alkalmazott tartományban nem érzékeny a nyomás megváltozására. (A hőugrásos kísérletek értékelésekor a triptofán fluoreszcencia inherens hőmérsékletfüggését is figyelembe kell

venni.) Az alkalmazott nyomásugrás (60 bar) nem okozott változást a NATA, valamint a nukleotidmentes, valamint ADP-vel illetve ADP.AlF4-dal komplexben lévő W501+ motor domén fluoreszcenciájában (33a-b ábra, az ADP.AlF4 adatokat nem mutatjuk) AMPPNP illetve ADP.BeFx jelenlétében azonban a hőugrásos kísérletben látottakhoz hasonló sebességű tranzienseket kaptunk (33c-d ábra). Ez arra utal, hogy ugyanazt a lépést, vagyis a nyitott-zárt konformációs átmenetet perturbáltuk ebben a kísérletben is. A nyomás emelkedésével a fluoreszcencia csökkenése járt együtt, ami azt jelzi, hogy a magasabb nyomás a nyitott konformáció felé tolja el az egyensúlyt. A nyomás-emelkedéses és nyomás-csökkenéses tranziensek sebessége és amplitúdójának nagysága (0,5-1 %) hasonló volt. Ezek szerint az alkalmazott perturbáció elegendően kis mértékű volt ahhoz, hogy elsőrendű relaxációt eredményezzen. A hőmérséklet és a nyomás mellett a

nyitott-zárt konformációs egyensúlyi állandó a közeg ionerősségével is befolyásolható, amint az egy, a kísérleteinkkel körülbelül egy időben publikált közleményből (101) kiderül. Az oldat ionerejének növelése a zárt állapot felé tolta el a rendszert, vélhetőleg a vázizom miozin S1-ben nyitott állapotban létrejövő Glu501-Lys505 és/vagy Glu776-Lys84 sóhidak perturbációja miatt. 22 72 1.002 1.002 1.000 1.000 Fluoreszcencia a) Fluoreszcencia Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése 0.998 0.996 0.994 0.992 0.990 apo 0.988 0 2 4 6 8 b) 0.998 0.996 0.994 0.992 0.990 ADP 0.988 0 10 2 4 10 1.002 1.002 d) 1.000 Fluoreszcencia 1.000 Fluoreszcencia 8 Idõ (ms) Idõ (ms) c) 6 0.998 0.996 0.994 0.992 0.990 ADP.BeFx 0.988 0 2 4 0.998 0.996 0.994 0.992 0.990 AMP.PNP 0.988 6 8 10 0 2 Idõ (ms) 4 6 8 10 Idõ (ms) 1.002 e) Fluoreszcencia Fluoreszcencia

f) 1.000 1.000 0.998 0.996 0.994 0.992 0.990 0.998 0.996 ATP 0.988 0 2 4 Idõ (ms) 6 8 ATP 10 0.0 0.5 1.0 Idõ (s) 33. ábra: A W501+ motor domén nyomásugrásos tranziensei különböző állapotokban a) apo,b) ADP, c) ADP.BeFx, d) AMPPNP, e) ATP (gyors fázis), f) ATP (lassú fázis) Fekete színnel a nyomásemelkedéses, naranccsal a nyomáscsökkenéses tranzienseket tüntettem fel. A kapott lefutásokhoz egyfázisú exponenciálisokat (piros) illesztettünk. ATP-ben két külön időskálán (10 ms ill. 1 s) vettük fel a lefutásokat (e ill f ábra) Az egyensúlyok perturbálásának jellegzetessége, hogy a komponensek koncentrációjának relatív változása függ az egyensúlyi állandó nagyságától. Elsőrendű reakció esetén a (∆c/c)/(∆K/K) hányados akkor maximális, ha K=1. Minél nagyobb mértékben tér el az egyensúlyi állandó az egységnyitől, a koncentrációk (és így a fluoreszcencia) relatív változása annál kisebb lesz az

egyensúlyi állandó relatív változásához képest. A változások amplitúdójából, illetve annak hőfüggéséből ezért az egyensúlyi állandó nagysága megbecsülhető. ADPBeFx-ban az amplitúdó maximuma 10-15oC körül, míg AMP.PNP-ben 20oC felett volt, ami összhangban van azzal, hogy a hőfüggéses kísérletekben is ilyen hőmérsékleteknél adódott 1 körüli app Koc érték. A ∆K/K = ∆p∆V/RT összefüggésből kiszámítható a nyitott-zárt átmenettel együtt járó térfogatváltozás, amely ADP.BeFx esetén +40 ml/mol-nak, AMPPNP-ben pedig +24 ml/molnak adódott 73 Doktori értekezés ATP-ben is látható volt az ADP.BeFx-ban és AMPPNP-ben megfigyelt gyors fázis (20oC-on kobs ≈ 1000 s–1, 33e ábra), azonban annak amplitúdója mindössze kb. 20 %-a volt az ADPBeFxban tapasztaltnak Ezen kívül megjelent egy másik, lassabb fázis is (20oC-on kobs = 24 s–1, 33f ábra), amelynek amplitúdója a vizsgált hőmérsékleti tartományban

mindvégig kb. kétszerese volt a gyors fázisénak. Ez utóbbi fázis megfigyelt sebességi állandója megfelel a megállított áramlásos kísérletben a hidrolízissel egyidejű fluoreszcencia-emelkedésnek. A kapott tranziensek azt sugallják, hogy ATP-áz steady-state-ben nyomással történő perturbációkor a nyitott-zárt egyensúly gyors átrendeződését az utána következő, nyomásra nem (feltétlenül) érzékeny hidrolízis-lépés csatolt relaxációja követi. (K3a megváltozik, ezért – jóllehet K3b-ben nem következik be változás – mind az M*.ATP, mind az M*.ADPPi komponensek steady-state koncentrációja is megváltozik) A hőmérséklet csökkenésével a teljes változás amplitúdója növekedett, ami egybevág azzal a 25 3 2x10 20 15 10 o 5 C AMP.PNP 34. ábra: Az ATP-ben tapasztalt gyors fázis, illetve az AMP.PNP-ben és ADP.BeFx-ban felvett egyfázisű tranziensek megfigyelt sebességi állandóinak hőmérsékletfüggése -1 kobs(s ) 2

8x10 2 6x10 2 4x10 2 2x10 ATP ADP.BeFx 0.0034 0.0035 0.0036 -1 1/ T (K ) megfigyeléssel (5.422 fejezet), hogy app Koc értéke ATP-ben a teljes vizsgált hőmérsékleti tartományban nagyobb 1-nél, és a hőmérséklet csökkenésével értéke csökken. A megfigyelt sebességi állandók hőmérsékletfüggése a 34. ábrán látható 5.46 A két csatolt lépés dinamikus modellje A hő- illetve nyomásugrásos tranziensek és a megállított áramlásos mérések analíziséből, valamint a W501+ steady-state fluoreszcencia hőfüggéséből a 9. séma szerinti kinetikai modell állítható fel (20oC-on; a többi számított paramétert a 4. táblázat tartalmazza): 3a 3b 350 s–1 M†.ATP 90 s–1 M*.ATP 870 s–1 nyitott 74 M*.ADPPi 1,1 s–1 zárt zárt 9. séma Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése Amikor az enzim ATP-t köt az aktív helyen, akkor a nyitott-zárt konformációs átmenet (3a

lépés) kis aktivációs energia-gáttal, illetve csekély szabadenergia-változással járó, gyors, reverzibilis lépés. A nyomás megváltoztatása elsősorban ezt a lépést perturbálja Nem zárható ki a hidrolízislépés (3b) nyomás-érzékenysége sem, a kapott tranziensek azonban egyértelműen leírhatók ez utóbbi lépés kapcsolt relaxációjával, vagyis a hidrolízishez rendelhető tranziens pusztán az M*.ATP komponens koncentrációjának gyors megváltozásából adódhat A nyitott-zárt egyensúly kis mértékben a nyitott állapot felé van eltolva (K3a ≈ 0,4), azonban a következő hidrolízis-lépés (amely egyébként szintén reverzibilis: K3b ≈ 80) „elhúzza” azt a zárt konformációjú M*.ATP komponens irányába Ha azonban összehasonlítjuk ez utóbbi komponensnek az M†.ATP illetve M*.ADPPi állapotok felé irányuló átmeneteinek sebességi állandóit (k–3a illetve k+3b), akkor azt látjuk, hogy a konformáció „visszaalakulása” kb.

10-szer gyakrabban történik meg, mint a hidrolízis irányába történő átmenet. A kialakított kinetikai modell összhangban van a szerkezeti megközelítéssel annyiban, hogy a switch-II huroknak először be kell záródnia, és csak ezután történhet meg az ATP hidrolízise. A tisztán szerkezeti nézőpontnál dinamikusabb képet rajzol azonban a folyamatról a tekintetben, hogy az enzim többször oszcillál a nyitott és zárt állapotok között – amit vélhetőleg a molekula erőkarjának mozgása is kísér –, mielőtt az aktív helyen a hidrolízis megtörténne. Tehát a miozin fejnek az ATP-hidrolízishez kapcsolt egyszerű „felhúzásánál” sokirányúbb, „mozgalmasabb” mechanizmusról van szó. Urbanke és Wray (102) vázizom miozin S1-en végzett hőugrásos kísérleteik alapján párhuzamos reakcióutat is tartalmazó modellt javasoltak, amelyben a hidrolízis mindkét konformáció-állapotban megtörténhet. A reakció azonban ez utóbbi modell

alapján is legnagyobbrészt a M†.ATP M*.ATP M*.ADPPi útvonalon játszódik le A Geeves és Holmes (46) által javasolt mechanizmus „metastabil” M*.ATP komponenst ír le, amely mindkét irányba (k–3a , k+3b) gyorsan bomlik le. A jelen modell alapján azonban ez az állapot stabilan jelen van ATP-áz steady-state-ben, mivel a 3a egyensúly már azelőtt kialakul, mielőtt a hidrolízis (k+3b) jelentős mértékben lejátszódna. Az M†ATP és M*.ATP komponensek aktin jelenlétében is egyensúlyban vannak, mivel az átmenet az aktomiozin disszociációnál (kobs ≈ 400 s– 1 , (65)) is gyorsabban játszódik le. A miozin nyaka csak aktinhoz kötött állapotban szolgálhat erőkarként. A reverzibilis nyitott- zárt konformációs átmenet aktinról levált állapotban a két filamentum elcsúszása helyett a miozin fejek gyorsan oszcilláló mozgásával jár a vastag filamentumhoz képest. Ez a mozgás magyarázattal szolgál az erőkar-kilendülés detektálásának

nehézségére (2.1 fejezet) Annak, hogy egy ATP hidrolízise során a fejekben többször megtörténik a nagy konformáció-változás, az aktin 75 Doktori értekezés filamentum megfelelő kötőhelyének „megtalálásában”, illetve az aktinról levált és aktin-kötött állapotok életidejének meghatározásában lehet szerepe. Mind a nyitott-zárt konformációs átmenet, mind pedig az ATP-hidrolízis lépés reverzibilis. A két lépés között kapcsoltság áll fenn, mivel az ATP hidrolízise csak zárt konformációban történhet meg. Mivel azonban a konformációs átmenet gyors, a hidrolízis megtörténte előtt a miozin fej többször oszcillál a felhúzott és lecsapott konformációk között. 76 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése 5.5 Az ATP-hidrolízis sebességének „finomhangolása” szubdomének közötti kölcsönhatások megváltoztatásával A miozin fej N- és C-terminális

szubdoménjeinek kölcsönhatási felszíne jelentős átrendeződéseken megy keresztül a nyitott-zárt konformáció-változás során. Befolyásolható-e a konformációs egyensúly a kölcsönhatások megváltoztatásával és ha igen, a katalitikus lépéshez való kapcsoltság folytán ez a változás milyen hatással van az ATPhidrolízis sebességére? 5.51 Szerkezeti háttér – szubdomén-mozgások a miozin fejben A rendelkezésre álló szerkezeti adatok alapján a miozin motor domén nagy konformációs átmenetei – és így a nyitott-zárt átalakulás is – a fej szubdoménjeinek mint rigid testeknek az őket összekötő hajlékony csuklópontok körüli elmozdulásaiként foghatók fel. Ezek a molekuláris mozgások a szubdomének közötti kölcsönhatási felszínek megváltozásával, illetve egyes esetekben teljes felbomlásával járnak együtt. A motor domén Nterminális szubdoménjének és a Cterminális konverter régiónak a kölcsönhatási

felszíne egyike azoknak a régióknak, amelyek igen jelentős átrendeződéseken mennek keresztül az ATP-áz ciklus során. A Dictyostelium miozin motor doménnek a nyitott, illetve zárt konformációs állapotokat indukáló nukleotid-analógokkal alkotott komplexeiben kristály- vizsgált szerkezetei alapján megállapítható, 35. ábra: a) A Dictyostelium motor domén K84 és R704 24a.minosavaival ábra: A W501+ konformációs szubállapotainak egyensúlya és k a homológ pozíciók elhelyezkedése a miozin fej zárt és hogy nyitott konformációban a nyitott szerkezeteiben állapotaival M5: 5 ns-os életidő-kom Lys84 aminosav a szomszédos M0b): statikusan kioltott, Mvalamint 1: 1 ns-os, A 84 és 704 pozíciók, a környező aminosavak egyensúlyi részarányukat tüntett elhelyezkedése a Dictyostelium motor domén nyitott térszerkezetében aminosavakkal együtt, amelyek a 77 Doktori értekezés molekula N-terminális, ún. 25 kDa szubdoménjében helyezkednek

el, az Arg704 (vázizom miozinban Arg723) és az azt követő aminosavak közelségébe kerül (35a-b ábra). Az utóbbi aminosav-csoport a motor domén C-terminális szubdoménjében (konverter régió) található. Zárt konformációban a konverter jelentős elmozdulása miatt ez a komplex felbomlik. A fentiek alapján a Lys84-Arg704 kölcsönhatásnak szerepe lehet a nyitott-zárt egyensúlyi állandó „finomhangolásában”. A vázizom miozin S1-ben a Lys84 oldallánc (ún. „reaktív lizin”) trinitrobenzol-szulfonsavval (TNBS) három nagyságrenddel gyorsabban reagál, mint a molekula többi lizil oldallánca (103). A reakció ATP-vel, ADP-vel és ATP analógokkal gátolható, ami konformáció-érzékenységére utal (104). A Lys 84 pK-jának csökkenéséért és így – legalábbis részben – kiemelkedő reaktivitásáért is az Arg704 oldallánc közelsége lehet felelős. A Lys84 trinitrofenilálása a steady-state MgATP-áz aktivitás 20-szoros

növekedését okozza, és a molekulák többsége a nyitott állapotot foglalja el. 5.52 Irányított mutációk az N-terminális és konverter szubdomének kölcsönhatási felszínén A Lys84 és Arg704 konzervatív aminosav-pozíciók a konvencionális miozinokban, ami arra utal, hogy funkcionális jelentőségük lehet. Mivel ez a régió az ATP kötőhelytől távolabb helyezkedik el, a Lys84 és/vagy Arg704 módosítása valószínűleg nem befolyásolja közvetlenül a nukleotid-kötési folyamatot. Annak felderítésére, hogy a Lys84 és Arg704 közötti taszító kölcsönhatás megváltoztatása hogyan befolyásolja az ATP-áz működést, pontmutációkat építettünk be a Dictyostelium miozin motor doménbe. Az itt bemutatott mutációkat az előnyös spektroszkópiai tulajdonságokkal rendelkező W501+ motor doménbe (lásd 5.22 fejezet) vittük be, amely a vad típusú fehérjéhez igen hasonló kinetikai sajátságokat mutat, és rendelkezik azzal az előnnyel is,

hogy segítségével az egyes konformációs állapotok érzékenyen megkülönböztethetők. A következő mutánsokat készítettük el: (a) A Lys84 metioninra való kicserélésével (W501+/K84M) vizsgálható az a hatás, amelyet a pozitív töltésű oldalláncnak a 84-es pozícióból történő eltávolítása, illetve egy megközelítőleg izosztérikus semleges oldallánccal való helyettesítése okoz; (b) A Lys84, illetve Arg704 negatív töltésű oldalláncú aminosavval való helyettesítése révén (W501+/K84E, W501+/R704E) az eredetileg taszító kölcsönhatás sóhíddá alakítható át. Így kideríthető, hogy ez a változtatás előidézi-e a nyitott-zárt egyensúlynak a nyitott állapot felé való jelentős eltolódását, illetve azt, hogy a csere hogyan hat az ATP-áz mechanizmus egészére; 78 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése (c) Szintén fontos azt megvizsgálni, hogy mindkét pozitív

töltésű oldallánc glutaminsavra cserélésével (W501+/K84E-R704E) visszaállíthatók-e az eredeti fehérje tulajdonságai. A fenti konstrukciók közül a dolgozat írásának időpontjáig a W501+/K84M és W501+/R704E mutánsokat expresszáltuk, ezért a következőkben ezek tulajdonságainak a „vad típusú” (W501+) enzimmel való összehasonlításáról lesz szó. 5.53 Steady-state fluoreszcencia: konformációs állapotok részaránya ATP-ben, AMP.PNP-ben, ADPBeFx-ban A nyitott-zárt egyensúlyi állandót nukleotid-analógok jelenlétében, valamint a steady-state ATPáz konformációs összetételét a W501 steady-state fluoreszcencia-intenzitásának hőmérsékletfüggésén keresztül vizsgáltuk, az 5.42 fejezetben már leírt módon A kontrollként használt W501+ mutáns a korábbi mérésekhez (lásd 29. ábra) képest némileg eltérő viselkedést mutatott (36a ábra). Az eltérés ATP-ben volt a legjelentősebb: az újonnan elvégzett kísérletekben

nem követte szorosan az ADP.AlF4 komplex (100 % zárt állapot) fluoreszcencia-intenzitását, hanem annál még magasabb hőmérsékleteken (20-25oC) is jelentősen alacsonyabban futott. Ezt a hőmérsékletfüggést támasztják alá a nyomásugrásos kísérlet adatai is, amelyek alapján az várható, hogy az alacsony fluoreszcenciájú M†.ATP állapot jelentős arányban (kb 30 %) van jelen ATP steady-state-ben (lásd a 4. táblázat adatait) Szintén megjegyzendő, hogy az ADPAlF4 illetve ATP jelenlétében mért hőfüggésnek a korábbi kísérletekben alacsony hőmérsékleteknél tapasztalt, nem tisztázott eredetű „lehajlása” sem jelentkezett ez esetben ADP.AlF4 esetén A W501+/K84M illetve W501+/R704E mutánsok fluoreszcencia-intenzitása nukleotidmentes állapotban a W501+ motor doménéhez hasonló volt, és a konformációs átmenetekre is ahhoz hasonló fluoreszcencia-változásokat mutattak (36b-c ábra). Az ADP illetve ADPAlF4 komplexek fluoreszcenciájának

hőfüggése ez esetben is az apo állapotéval megegyező meredekségű volt, így ezeket 100 %-ban nyitott illetve zárt állapotúnak tekintettük. A 36a-c ábrákon, valamint a fluoreszcencia-adatok alapján készült van’t Hoff-ábrázolásokon (37a-c ábra) illetve az azokból számolt termodinamikai paraméterekben (5. táblázat) szembeötlő tendencia mutatkozik meg: mind nukleotid-analógok (AMP.PNP, ADPBeFx) jelenlétében, mind pedig ATP-ben jellegzetes eltolódás tapasztalható a nyitott állapot irányába, mégpedig a kölcsönhatás vonzó jellegének erősödésével párhuzamosan (W501+ W501+/K84M W501+/R704E). Ez alól csak a W501+/K84M mutánsnak ATP jelenlétében a W501+-hoz képest némileg a zárt állapot felé való eltolódása képez kivételt. 79 Doktori értekezés A W501+ ATP állapot fluoreszcenciájának a két méréssorozat közti eltérései ellenére – szem előtt tartva azt, hogy az egyensúlyi állandók e módszer alapján történő

meghatározása bizonytalanná válik valamely állapot erős túlsúlyba kerülésekor (vagyis, ha K < 0,1 vagy K > 10) – a következő megállapítások tehetők a mutációk hatására vonatkozólag: (a) A nyitott-zárt egyensúly mindhárom vizsgált fehérje és ligandum esetén nagy entalpianövekedéssel, ám viszonylag csekély szabadenergia-változással járó folyamat; (b) A mutációk nem változtatták meg alapvetően az egyes nukleotidoknak illetve analógoknak a nyitott illetve zárt konformáció-állapotokat indukáló sajátságait, ami arra utal, hogy az aktívhelyen nem okoztak jelentős szerkezeti változást; (c) A nyitott állapot termodinamikailag kedvezőbbé válik a 84-704 kölcsönhatás vonzó jellegének erősödésével. 2.0 W501+ a) Fluoreszcencia 1.8 1.6 1.4 ADP.AlF4 ATP ADP.BeFx AMP.PNP apo ADP 1.2 1.0 0.8 5 10 15 20 25 o t ( C) 2.6 b) W501+/K84M 2.4 Fluoreszcencia 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 5 10 15 20 25 o t ( C) 2.4

c) W501+/R704E 2.2 Fluoreszcencia 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 5 10 15 o t ( C) 80 20 25 36. ábra: Steady-state fluoreszcencia hőmérsékletfüggése a) W501+ b) W501+/K84M c) W501+/R704E Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése ATP 3 a) ln Koc 2 W501+/K84M 1 0 W501+ -1 W501+/R704E 0.00335 0.00340 0.00345 0.00350 0.00355 -1 1/ T (K ) ADP.BeFx 0.0 -0.5 W501+ W501+/K84M ln Koc b) -1.0 -1.5 W501+/R704E -2.0 0.00335 0.00340 0.00345 0.00350 0.00355 -1 1/ T (K ) -1.0 AMP.PNP -1.5 W501+ W501+/K84M ln Koc -2.0 37. ábra: A nyitott-zárt egyensúlyi állandó van’t Hoff-ábrázolásai (W501+, W501+/K84M, W501+/R704E) a) ATP b) ADP.BeFx c) AMP.PNP A nyitott-zárt egyensúlyi állandót (Koc) a 36. ábrán bemutatott fluoreszcenciaintenzitásokból számítottuk: Koc=(Fminta-Fo)/(Fc-Fminta) ahol Fo a nyitott (ADP), Fc a zárt (ADP.AlF4) állapot intenzitása -2.5 W501+/R704E -3.0 -3.5

0.00335 0.00340 0.00345 0.00350 0.00355 -1 1/ T (K ) 5.54 A nyitott-zárt egyensúly és az ATP-hidrolízis sebesség megváltozása A K84M illetve R704E mutációknak az ATP-áz ciklus lépéseire gyakorolt hatását megállított áramlásos mérésekkel vizsgáltuk. Az ADP kötése a mutánsok esetén a W501+ motor doménéhez hasonló tranzienseket mutatott (az adatokat itt nem mutatjuk), ami azt jelzi, hogy a nukleotidkötési folyamat (1-2. lépés az 1 sémában) kinetikájában az aminosavcserék nem okoztak lényeges változást. Ezt támasztja alá az ATP-vel történő kölcsönhatás során alacsony hőmérsékleten 81 Doktori értekezés tapasztalt átmeneti fluoreszcencia- 1.4 csökkenés sebessége is, amely Fluoreszcencia A B szintén 1.2 a kötési folyamatról szolgáltat információt. Lényeges, W501+ 1.0 és a steady-state fluoreszcencia-kísérletek eredmé0.8 10 W501+/K84M -4 10 -3 10 nyeivel összhangban lévő változás

W501+/R704E -2 10 Idõ (s) -1 10 0 10 volt azonban tapasztalható két 1 38. ábra: A W501+, W501+/K84M és W501+/R704E mutánsok ATP-vel történő reakciójának megállított áramlásos tranziensei t=5oC, koncentrációk: 2 µM motor domén, 300 µM ATP sajátság tekintetében: (a) Az ATP-vel való összekeveréskor látható kezdeti csökkenés a hőmérsékleti teljes vizsgált tartományban (5- 20oC) nagyobb volt W501+/K84M illetve W501+/R704E esetén, mint a W501+ motor doménnel. Ez azt jelenti, hogy míg utóbbinál az említett csökkenés csak 10oC alatt kezd észlelhetővé válni (lásd 5.43 fejezet), addig mindkét 84-704 régió-mutáns esetén már 20oC-on is detektálható, 5oC-on (38. ábra) pedig mértéke eléri a 20 %-ot, ami azt jelzi, hogy a 3a egyensúlyban a nyitott állapot erősen favorizált ATP-ben23. (b) A hidrolízis nagy ATPkoncentrációnál 30 -1 kobs (s ) W501+ ségi állandója 20oC-on a W501+ ra 10 0 µM) megfigyelhető

maximális sebes- W501+/K84M 20 (>200 W501+/R704E jellemző 30 s–1 értékről W501/K84M esetén 17 s–1-re, W501+/R704E esetén pedig 12 s–1-re csökkent (39. ábra) Ez a 0 200 400 600 800 1000 [ATP] (µM) tendencia a hőmérsékleti 39. ábra: A hidrolízis megfigyelt sebességi állandójának ATPkoncentrációfüggése (20oC) teljes vizsgált tartományban érvényesült (5-20oC, 40. ábra) 23 A megállított áramlásos tranziensekből az is kiolvasható, hogy a W501+/K84M mutáns esetén ATP-ben a K3a egyensúlyi állandó inkább a W501+/R704E-re jellemző alacsony értéket mutat (a kezdeti fluoreszcencia-csökkenés mértéke alapján, lásd 19a ábra). Eszerint a még a W501+-nál is magasabb steadystate fluoreszcencia-értékek ATP-ben (17a-b ábra) a csak a W501+/K84M esetén jelentkező lassú (kobs < 0,1 s–1), azonosítatlan eredetű fluoreszcencia-emelkedési fázis (lásd 19a ábra) következményei. 82 Lépésről lépésre –

egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése 30 40. ábra: A hidrolízis maximális megfigyelt sebességi állandójának hőmérsékletfüggése W501+ -1 kobs (s ) 20 W501+/K84M 10 W501+/R704E 0 5 10 15 20 o t ( C) Az, hogy a mutánsokban a nyitott-zárt konformációs egyensúlynak a nyitott állapot felé való eltolódása a hidrolízis-sebesség arányos csökkenésével jár együtt, újabb kísérleti alátámasztását adja az 5.46 fejezetben ismertetett lineáris kinetikai modellnek Eszerint a hidrolízis csak zárt állapotban következhet be, és ha a 3a egyensúly a nyitott állapotot favorizálja (K3a < 1, ami a W501+-hoz képest még kifejezettebb a 84-704 régió mutánsokban), akkor megfigyelt sebességi állandója kobs= K3ak+3b szerint alakul. A konformációs egyensúly így befolyásolja a hidrolízis sebességét, és befolyásolásával az ATP-áz mintegy „finomhangolható” (10. séma) K84M R704E (3a lépés) (3b

lépés) M†.ATP M*.ATP nyitott zárt K84–R704 M*.ADPPi zárt K84 . R704 10. séma A mutációk a nyitott-zárt átmenet (3a lépés) kinetikai paramétereit jelentősen befolyásolták – a katalitikus lépését (3b) sokkal kevésbé vagy egyáltalán nem. Ezek a kísérleteink így azt igazolták, hogy az N-terminális és konverter szubdomének közötti kölcsönhatás a nyitott-zárt egyensúly révén képes befolyásolni az ATP-hidrolízis sebességét. 83 Doktori értekezés Az általunk bevitt mutációkhoz hasonló aminosavcserék az evolúció során is lejátszódtak a motor domén e régiójában. A miozin VI osztályban például semleges-semleges (Ser-Met), miozin V-ben semleges-pozitív töltésű (Ile-Arg), míg a miozin I és X osztályokban sóhídképző (Asp/Glu-Arg) aminosavpár található a fentiekkel homológ pozíciókban (92). Jóllehet ezeknek az izoformáknak az atomi szerkezete nem ismert, és az eddigi adatok az N-terminális

szubdomén érintett részében szerkezetbeli variabilitásra utalnak, elképzelhető, hogy a konvencionális miozinokban létrejövő 84-704 kölcsönhatásnak más izoformák esetében is szerepe van az enzimatikus sajátságok meghatározásában, így az a miozin motorok funkcionális diverzitásához járulhat hozzá. 5.55 A mutációk hatása a foszfát felszabadulására Mint láttuk, a miozin motor domén ATP-kötött állapotában a hidrolízis előtt átmegy a nyitottzárt konformációs átalakuláson. Ahhoz azonban, hogy a hidrolízis-termékek közül elsőként felszabaduló foszfátion a „hátsó ajtón” keresztül el tudjon távozni az aktívhelyről, a switch-II huroknak előzőleg ismét ki kell nyílnia. (A zárt kristályszerkezetekben a γ-foszfát helyen kötött csoport felületének több, mint 95 %-ában el van zárva az oldószertől.) A foszfát felszabadulása kinetikai és termodinamikai szempontból igen fontos lépés, mivel irreverzibilis és ez a

ciklus sebesség-meghatározó lépése. A folyamat részletei azonban igen kevéssé tisztázottak Vizsgálatának egyik módja lehet „visszafelé” lejátszatni e lépéseket, azaz a miozin.ADP komplex Pi-kötését vizsgálni. Nehézséget jelent azonban e megközelítésben a fenti komplex igen alacsony foszfát-affinitása (Kd > 1 mM). Jelenlegi ismereteink alapján ezért nem dönthető el, hogy a vélhetően a 11. séma szerint lejátszódó folyamatban, amely Dictyostelium miozin esetén 0,05 s–1 steady-state ATP-áz aktivitást határoz meg, (a) a K4 egyensúlyi állandó nagy, és a foszfát az M†.ADPPi állapotból kobs = k+5 = 0,05 s–1 sebességi állandóval szabadul fel, azaz ez utóbbi lépés önmagában sebesség-meghatározó, vagy pedig (b) K4 << 1, és így a folyamat nettó sebessége kobs = K4k+5 szerint alakul, vagyis a termékfelszabadulás sebességét az aktív helyén a hidrolízis-termékeket tartalmazó enzim zárt-nyitott konformációs

egyensúlya határozza meg 84 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése konformációs átmenet foszfátfelszabadulás (4. lépés) (5. lépés) M*.ADPPi M†.ADPPi zárt nyitott K4 = ? Steady-state ATP-áz (s-1) 0.2 M†.ADP + Pi k+5 = ? nyitott 11. séma A 41. ábrán tüntettük fel az általunk vizsgált mutánsok steadystate ATP-áz aktivitását. Ez a 0.16 sajátság 0.12 az ATP-hidrolízis sebességével (39. ábra) ellenkező, 0.08 ahhoz 0.04 tendenciát 0 wt W501+ W501+/K84M W501+/R704E 41. ábra: A W501+, W501+/K84M és W501+/R704E mutánsok bazális steady-state ATP-áz aktivitása a vad típusú Dictyostelium motor doménével összehasonlítva bekezdés arányaiban mutat. (b) hasonló Az előző pontjában vázolt lehetőség, azaz a konformációs egyensúly és a foszfátfelszabadulás közötti csatoltság megmagyarázhatja a hidrolízis-sebesség lassulásának és a steady-state

aktivitás gyorsulásának egyidejű jelentkezését. Az itt bemutatott pontmutációk hatásához igen hasonló változásokat okoz a vázizom miozin konverter régió ún. SH1 oldalláncának kémiai módosítása is (105) A fluoreszcencia-vizsgálatok ez esetben is a nyitott állapot felé való eltolódásról tanúskodtak. A konformációs egyensúly befolyásolása tehát ellentétes hatást vált ki a csak zárt állapotban lejátszódó ATP-hidrolízis és a csak nyitott állapotban bekövetkező foszfátfelszabadulás sebességére. Az ismert nyitott és zárt kristályszerkezeteket aktin távollétében határozták meg. Az aktinnal való kölcsönhatás bizonyosan jelentős változásokat idéz elő a motor domén szerkezetében (46). Elképzelhető azonban, hogy az N-terminális és konverter szubdomének kölcsönhatási felszínének irányított mutációkkal illetve helyspecifikus jelöléssel történő módosítása az aktin-aktivációhoz hasonló hatással bír. Az

aktin is a foszfátfelszabadulási lépést gyorsítja, mégpedig vélhetőleg azáltal, hogy az aktin és a miozin közötti kölcsönhatások a motor domén egy olyan konformációját teszik energetikailag kedvezővé, amelyben a switch-II nyitott állapotban van. Ezzel ellentétben aktin távollétében ADP.Pi állapotban a foszfátionnal létesített kiterjedt kölcsönhatás- 85 Doktori értekezés rendszer miatt a zárt állapot lehet kedvezőbb. Közvetlen bizonyíték azonban nincs birtokunkban a vázolt termékfelszabadulási mechanizmusok egyikére sem. A csak nyitott állapotban létrejövő K84-R704 taszító kölcsönhatás megváltoztatása a kölcsönhatás vonzó jellegének erősödésével stabilizálja a nyitott konformációt. A konformációs egyensúly ilyen irányú megváltoztatása a csak zárt állapotban megtörténő ATP-hidrolízis lassulását, illetve a csak nyitott állapotban bekövetkező foszfátfelszabadulás gyorsulását eredményezi, az

enzimműködés tehát ily módon „finomhangolható”. 86 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése 6 Konklúziók A miozin ATP-áz ciklus áttekintő sémája a dolgozatban ismertetett modelljeink alapján az alábbiak szerint írható fel: 1 M + ATP 2a M.ATP 1’ 2b † 1 M†2.ATP M .ATP M††.ATP ATP-kötés 3a nyitott-zárt átmenet és ATP-hidrolízis M*.ATP 3b M*.ADPPi foszfátfelszabadulás ADP-disszociáció 7 M + ADP 7’ I M.ADP 4 M†2.ADPPi 5 6a M†1.ADP 6b M†2.ADP M††.ADP Egy-triptofános mutánsok segítségével kimutattuk, hogy a nukleotid kötésekor fellépő fluoreszcencia-változásokhoz mind a kötőzsebben, mind a relé-hurokban elhelyezkedő triptofánok hozzájárulnak. A molekula ezen pontjain elhelyezett szenzorok időfelbontott fluoreszcens vizsgálatával a motor három különböző, a globális konformációs átmeneteknél gyorsabb egyensúlyban lévő szubállapotát

mutattuk ki. 87 Doktori értekezés II A nukleotid-kötés és -felszabadulás lépéseire szelektív és nagy jelváltozást mutató mutáns Dictyostelium miozin motor domének kinetikai analízise révén ezen folyamatoknak az eddiginél részletesebb modelljét alkottuk meg, amelyben a másodrendű ütközési lépést két konszekutív izomerizáció követi. Az eredmények ugyanakkor egy párhuzamos reakcióút létére is rávilágítanak, amely egy, a szubsztrát nem optimális elhelyezkedése miatt gyengén kötött állapoton keresztül megvalósuló kötési mechanizmusra utal. M + ATP (1’ lépés) III ütközési lépés izomerizáció izomerizáció (1 lépés) (2a lépés) (2b lépés) M†1.ATP M.ATP M†2.ATP M††.ATP Relaxációs kinetikai technikákkal kimutattuk, hogy a nyitott és zárt konformációk közötti átmenet és az ATP-hidrolízis különálló lépések, amelyek között kapcsoltság áll fenn, mert a hidrolízis csak zárt

állapotban történhet meg. Mivel azonban a konformációs átmenet jóval gyorsabb, mint a hidrolízis, a miozin fej többször oszcillál a két konformáció-állapot között – amely mozgást minden bizonnyal az erőkar elmozdulása is kísér, mielőtt az aktívhelyen az ATP hidrolízise megtörténne. 88 konformációs átmenet hidrolízis (3a lépés) (3b lépés) M†.ATP M*.ATP nyitott zárt M*.ADPPi zárt Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése IV A miozin fej két szubdoménjének kölcsönhatási felszínén a nyitott konformációban létrejövő taszító kölcsönhatás pontmutációkkal történő megváltoztatása – a kölcsönhatás vonzó jellegének erősödésével arányosan – megnövelte a nyitott konformációjú molekulák részarányát az ATP-áz reakció steady-state szakaszában. A mutációk csak a nyitott-zárt átmenet kinetikai paramétereit befolyásolták, a

hidrolízis-lépését nem. A konformációs átmenet egyensúlyi állandójának megváltozása a két lépés kapcsoltsága folytán viszont befolyásolja a hidrolízis sebességét, így kimutattuk, hogy a vizsgált kölcsönhatásnak fontos szerepe lehet az ATPhidrolízis „finomhangolásában”. K84M R704E (3a lépés) (3b lépés) M†.ATP M*.ATP nyitott zárt K84–R704 M*.ADPPi zárt K84 . R704 89 Doktori értekezés 7 Perspektíva Bemutatott kísérleteinkkel sikerült elindulnunk azon az irányvonalon, amely a kinetikai és szerkezeti szemléletmódok integrálásával a miozin motorok működését és az erőgenerálást annak dinamikus valójában igyekszik „megfogni”, megérteni. Az eredmények amellett, hogy megoldást kínálnak számos, eleddig tisztázatlan problémára, a kísérleti eszköztár további szélesítésével újabb ígéretes kifutási lehetőségek felé is utat nyitnak. Az 5.5 fejezetből kitűnik, hogy a 84 és 704

aminosavakat tartalmazó kölcsönhatási felszín mutagenezissel történő vizsgálata korántsem befejezett történet. Az eredmények fontos kiegészítését fogják adni a W501+/K84E és W501+/K84E-R704E mutánsokon végzett vizsgálatok. A mutációknak a 3a és 3b lépésekre gyakorolt hatását közvetlenül nyomásugrással tervezzük vizsgálni. Mivel az eddigi adatok alapján elmondható, hogy a motor domén e dinamikus átrendeződéseken keresztülmenő régiójába bevitt pontmutációk – a 84 és 704 pozíciók illetve közvetlen környezetük viszonylagos konzervativitása ellenére – nem „teszik tönkre” szükségszerűen az enzimet, ezért a K84-R704 kölcsönhatás vizsgálatán túlmutatóan egyéb riporterek is bevihetők a molekulának ezekre az „izgalmas” pontjaira. Egy olyan mutáns segítségével például, amelyben mindkét aminosavat ciszteinre cserélünk (W501+/K84C-R704C), megvizsgálhatjuk, hogy ezek az oldalláncok oxidáció révén

keresztköthetők-e a különböző konformációs állapotokban. A diszulfidhíddal keresztkötött fehérjéről kideríthető, hogy a nukleotid az aktív helyre bezárva marad-e a keresztkötés révén, illetve, hogy az enzim eredeti tulajdonságai a ciszteinek redukciójával visszaállíthatók-e24. E mutáns másik előnye, hogy helyspecifikusan jelölhető riporter csoportokkal, amelyek a régió molekuláris mozgásainak vizsgálatán túl a molekulán belül, a szubdomének között fellépő erőhatások vizsgálatát is lehetővé teszik. Fluoreszcens illetve spinpróbákkal szelektíven jelölhető cisztein-párokat a motor domén más pontjain is beépítettünk. Ilyen „izgalmas” régió például a felső és alsó 50 kDa szubdomének között elhelyezkedő hosszú hasíték (ún. aktin árok, lásd a 223 és 224 fejezetekben), amely az aktinnal való kölcsönhatás során valószínűleg jelentős átrendeződésen (bezáródás?) megy Hasonló keresztkötési

kísérletet már végeztek egy olyan W501+ Dictyostelium motor doménnel, amelyben az Arg238 és Glu459 aminosavak helyett szerepel cisztein (Málnási-Csizmadia A. személyes közlése) Ezen oldalláncok között csak a zárt struktúrában jön létre sóhíd (45), így a megfelelő diszulfid is csak ATP jelenlétében képződött, nukleotid távollétében nem. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a 84-704 keresztkötési kísérlet hasonló módon elvégezhető. 24 90 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése keresztül. Az e pontokon elhelyezett szenzorok a motor szubdomén-kölcsönhatásainak dinamikáján kívül az aktin-kölcsönhatás vizsgálatára is alkalmasak. Amint láttuk, a motor működés kulcspontja pontosan ezeknek a kölcsönhatásoknak a dinamikája, hiszen ezeken keresztül valósul meg a nukleotid- és aktin kötőhelyek, illetve az effektor funkciójú erőkar közötti kommunikáció. A statikus

kristályszerkezeti modellek jelentősége a fehérjemolekula térbeli „feltérképezésében”, a lehetséges kommunikációs útvonalakon történő eligazodásban rejlik, azonban, mint azt a miozin esetében az utóbbi évtized tapasztalatai mutatják, ezek a modellek önmagukban nem adnak magyarázatot az erőgenerálás mikéntjére. Az aktív hely történéseinek az aktin kötőhellyel történő kölcsönhatás mellett az erőkarmozgáshoz való kapcsoltságát is tervezzük vizsgálni, a motor doménhez „mesterséges erőkarként” fuzionáltatott fluoreszcens fehérjék segítségével. A molekuláris motorok vizsgálatán túlmutatóan általános enzimológiai kérdéseket is feszegető, de csaknem teljesen felderítetlen terület az enzimek kinetikai-termodinamikai sajátságai és az általuk létrehozott erőhatások közötti kapcsolat. A miozin motor domén különböző pontjaihoz helyspecifikusan rögzített aktiválható „molekuláris rugók”

segítségével tervezzük vizsgálni a molekula által kifejtett erő és az intra- illetve intermolekuláris kölcsönhatások kinetikája közötti összefüggést. A fenti tervek nagyrészt már elvégzett ígéretes előkísérleteken alapulnak. Ezek a kísérletek teljesen új megközelítést képviselve járulhatnak hozzá az energiaátalakítás immáron több mint fél évszázada intenzíven kutatott, ám alapvető titkait még mindig rejtegető mechanizmusának megértéséhez. 91 Doktori értekezés 8 Köszönetnyilvánítás Legelőször szüleimnek szeretnék köszönetet mondani a lelki és szellemi útravalóért, amit tőlük kaptam. Támogatásukkal átsegítettek a nehézségeken, a sikereknek pedig még nálam is jobban örültek. Témavezetőm, Dr. Nyitray László immáron hetedik éve egyengeti pályafutásomat A szakdolgozati, tudományos diákköri, majd doktori munka során tanítványaként és munkatársaként a sokrétű szakmai, elméleti

és gyakorlati ismeretanyag mellett a tudomány, a kutatói lét emberi oldaláról is rendkívül sokat tanultam – és minden bizonnyal még fogok is tanulni – tőle, amihez didaktikai vénája mellett messzemenően liberális szemlélete, stílusa is nagyban hozzájárult. Köszönet érte Igen nehéz lenne tömören összefoglalni, mi mindenért vagyok hálás Dr. Málnási-Csizmadia Andrásnak, hiszen az elmúlt viszonylag hosszú időszakot – „fejlődésem” (ha lehet ilyesmiről beszélni) egyik meghatározó szakaszát – majdhogynem együtt éltük végig, tervek kovácsolása, érvek gyakran heves ütköztetése, baráti beszélgetések, utazások, de főként és elsősorban késő estébe nyúló mérések és adatsorok feletti töprengés közepette. Abbéli reményemnek szeretnék inkább hangot adni, hogy a jövőben is folytatódni fog ez a termékeny diskurzus. Családjának köszönöm a kivételes türelmet. Prof. Gráf Lászlónak ezúton szeretném

megköszönni, hogy lehetővé tette munkámat a tanszéken, és hogy kivétel nélkül minden esetben élvezhettem hathatós támogatását, amikor hozzá fordultam. Dr. Hegyi Györgynek és Dr Szilágyi Lászlónak köszönöm, hogy széleskörű szakmai tapasztalataikból mindig készségesen megosztották velem azt a szeletet, amire éppen szükség volt egy adott probléma megoldásához. Nagy Attila barátomnak (PTE ÁOK Biofizikai Intézet) köszönöm a támogatást és az izgalmas eszmecseréket. Tóth Juditnak vitakészsége és a sikeres közös munka mellett külön hálás vagyok, hogy írásműveim vadhajtásait udvariaskodást mellőző következetességgel lemetszette. Köszönöm az ELTE Biokémiai Tanszék minden dolgozójának segítőkészségét. Dr. Tölgyesi Ferencnek (SE ÁOK Biofizikai Intézet) köszönöm a spektroszkópiai szakkifejezések magyarításában nyújtott segítségét. 92 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének

kinetikai megközelítése A külföldi tanulmányutakat illetve konferencia-látogatást a Magyar Állami Eötvös Ösztöndíj (MÖB XLI/34/2000), az Oktatási Minisztérium Mecenatúra Pályázata (MEC-01722/2001), valamint a European Molecular Biology Organization (ASTF 9203, ASTF 9790) támogatta. 8.1 Acknowledgements I am greatly indebted to Prof. Clive R Bagshaw (University of Leicester, U K) for welcoming me in his lab and sharing with me a huge amount of theoretical and practical knowledge during the long discussions. I am also grateful for the fruitful collaboration and a lot of arrangements he made to make my life in the U. K easier Thanks to Robert J. Woolley for his helpfulness and extraordinary patience that helped him tolerate me for such a long time. I wish to thank Drs. Dietmar J Manstein and Menno L W Knetsch (Max Planck institute for Medical Research, Heidelberg, Germany) for their hospitability and for giving me the know-how of the Dictyostelium expression

system. I thank Dr. Stanley W Botchway (Rutherford Appleton Laboratory, Chilton, U K), Prof Michael A. Geeves and Dr David S Pearson (University of Kent at Canterbury, U K) for collaboration and discussions. 93 Doktori értekezés 9 Rövidítések jegyzéke ε: moláris extinkciós koefficiens τ: életidő φ: anizotrópia-lecsengési idő A: amplitúdó AMP.PNP: adenozin-5’-(β, γ-imidotrifoszfát) appK : látszólagos nyitott-zárt egyensúlyi állandó oc ATPγS: adenozin-5’-O-(3-tiotrifoszfát) E. coli: Escherichia coli ELC: esszenciális könnyűlánc F, illetve I: fluoreszcencia-intenzitás GuHCl: guanidin-hidroklorid HMM: nehéz meromiozin kDa: kilodalton kobs: megfigyelt sebességi állandó KSV: Stern-Volmer állandó LMM: könnyű meromiozin mant-: 2’(3’)-O-(N-metilantranilloil)MD: motor domén MDE: motor domén-esszenciális könnyűlánc fúziós fehérje NATA: N-acetil-L-triptofánamid NBS: N-bromo-szukcinimid NTA: nitrilotriacetát Pi: szervetlen foszfát

PPi: pirofoszfát Q: fluoreszcencia kvantumhatásfoka r: fluoreszcencia-anizotrópia rss: steady-state anizotrópia RLC: regulációs könnyűlánc S1, S2: szubfragmentum-1 ill. -2 SDS-PAGE: Na-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézis TES: N-trisz-(hidroximetil)metil-2-aminoetán-szulfonsav TNBS: 2,4,6-trinitrobenzol-szulfonsav Vi: vanadát X: külön nem megnevezett aminosavat helyettesítő szimbólum 94 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése 10 Ábrák és táblázatok jegyzéke 1. ábra 2 ábra 3. ábra 4. ábra 5. ábra 6. ábra 7. ábra 8. ábra 9. ábra 10. ábra 11. ábra 12. ábra 13. ábra 14. ábra 15. ábra 16. ábra 17. ábra 18. ábra 19. ábra 20. ábra 21. ábra 22. ábra 23. ábra 24. ábra 25. ábra 26. ábra 27. ábra 28. ábra 29. ábra 30. ábra 31. ábra 32. ábra 33. ábra A Lymn-Taylor modell A konvencionális miozinok doménszerkezete A csirke vázizom S1 szerkezete A szubdomének, az azokat

összekötő „kapcsok” és a kötőhelyek elhelyezkedése a motor doménben Az akto-S1 komplex rekonstruált szerkezete az erőkifejtő lépés előtt és után A pDXA expressziós vektorok szerkezete A rekombináns motor domének expressziója ATP-áz aktivitás mérése multiple turnover kísérlettel Megállított áramlásos mérőműszer sémája A relaxációs kísérletek általános sémája Hőugrásos mérőműszer sémája Nyomásugrásos mérőműszer sémája A relé-hurok triptofán elhelyezkedése a motor domén zárt és nyitott térszerkezeteiben A vad típusú, illetve W501+, W501- és W- motor domének fluoreszcencia-emissziós spektrumai A W501+ mutáns emissziós spektrumai nukleotid-mentes állapotban, illetve ADP, ATP és ADP.AlF4 jelenlétében A nukleotid kötőhely elhelyezkedése a Dictyostelium miozin motor doménben A beépített triptofán szenzorok pozíciója a kötött nukleotidhoz képest a Dictyostelium motor domén szerkezetében,

összehasonlítva a vázizom miozin homológ pozícióival Az egy-triptofános motor domének fluoreszcencia-emissziós spektrumai apo és nukleotidkötött állapotban Fluoreszcencia-kioltás akrilamiddal a W129+ motor doménben A W129+ motor domén fluoreszcencia intenzitás-lecsengési görbéi A W501+ motor domén fluoreszcencia intenzitás-lecsengési görbéi A W129+ és W501+ fluoreszcencia-emisszió komponenseinek részaránya apo, ADP és ATPkötött állapotban A W129+ fluoreszcencia anizotrópia-lecsengési profilja A W501+ konformációs szubállapotainak egyensúlya és kapcsolata a molekula globális konformáció-állapotaival a) A W129+ motor domén ADP-vel történő reakciójának néhány reprezentatív megállított áramlásos görbéje b) A kapott tranziensek gyors és lassú fázisai relatív amplitúdóinak nukleotidkoncentrációfüggése c) A gyors fázis megfigyelt sebességi állandóinak nukleotid-koncentrációfüggése d) A lassú fázis megfigyelt

sebességi állandóinak nukleotid-koncentrációfüggése A W129+/W501+ mutáns ATP-vel történő reakciójának lefutása A W129+/W501+ x ATP tranziensek gyors fluoreszcencia-csökkenési fázisának megfigyelt sebességi állandói A W129+/W501+ x ATP tranziensek lassú fluoreszcencia-emelkedési fázisának megfigyelt sebességi állandói A W501+ steady-state fluoreszcencia hőmérsékletfüggése A W501+ mutáns ATP-vel történő reakciójának lefutása különböző hőmérsékleteken A hidrolízis megfigyelt sebességi állandójának Arrhenius-ábrázolása A NATA és a W501+ motor domén hőugrásos tranziensei A W501+ motor domén nyomásugrásos tranziensei különböző állapotokban a) apo b) ADP c) ADP.BeFx d) AMP.PNP e) ATP (gyors fázis) 95 Doktori értekezés 34. ábra 35. ábra 36. ábra 37. ábra 38. ábra 39. ábra 40. ábra 41. ábra 1. táblázat 2. táblázat 3. táblázat 4. táblázat f) ATP (lassú fázis) Az ATP-ben tapasztalt gyors fázis

megfigyelt sebességi állandójának Arrhenius-ábrázolása a) A Dictyostelium motor domén K84 és R704 aminosavaival homológ pozíciók elhelyezkedése a miozin fej zárt és nyitott szerkezeteiben b) A 84 és 704 pozíciók, valamint a környező aminosavak elhelyezkedése a Dictyostelium motor domén nyitott térszerkezetében Steady-state fluoreszcencia hőmérsékletfüggése a) W501+ b) W501+/K84M c) W501+/R704E A nyitott-zárt egyensúlyi állandó van’t Hoff-ábrázolásai (W501+, W501+/K84M, W501+/R704E) a) ATP b) ADP.BeFx c) AMP.PNP A W501+, W501+/K84M és W501+/R704E mutánsok ATP-vel történő reakciójának megállított áramlásos tranziensei A hidrolízis megfigyelt sebességi állandójának ATP-koncentrációfüggése A hidrolízis maximális megfigyelt sebességi állandójának hőmérsékletfüggése A W501+, W501+/K84M és W501+/R704E mutánsok steady-state ATP-áz aktivitása a vad típusú Dictyostelium motor doménével összehasonlítva A miozin fej

publikált kristályszerkezetei Mutáns DNS konstrukciók leírása és elkészítésének módja A motor domén konstrukciók fluoreszcencia-emissziójának adatai A nyitott-zárt átmenet és az ATP-hidrolízis lépés kinetikai és termodinamikai paraméterei a W501+ motor doménen végzett kísérletek alapján 5. táblázat A nyitott-zárt egyensúly termodinamikai paraméterei a W501+, W501+/K84M és W501+/R704E mutánsok steady-state fluoreszcenciájának hőmérsékletfüggése alapján 96 Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése 11 Az értekezés alapjául szolgáló publikációk Málnási-Csizmadia, A., Kovács, M, Woolley, J R, Botchway, S W, Bagshaw, C R (2001): The dynamics of the relay loop tryptophan residue in the Dictyostelium myosin motor domain and the origin of spectroscopic signals. J Biol Chem 276(22): 19483-90 Málnási-Csizmadia, A., Pearson, D S, Kovács, M, Woolley, R J, Geeves, M A, Bagshaw, C R

(2001): Kinetic resolution of a conformational transition and the ATP hydrolysis step using relaxation methods with a Dictyostelium myosin II mutant containing a single tryptophan residue. Biochemistry 40(42): 12727-37. Kovács, M., Málnási-Csizmadia, A, Woolley, J R, Bagshaw, C R (2002): Analysis of nucleotide binding to Dictyostelium myosin II motor domains containing a single tryptophan near the active site. J Biol Chem. Papers in Press: published April 23, 2002 as 101074/jbcM202180200 Kovács, M., Málnási-Csizmadia, A, Woolley, J R, Bagshaw, C R (2002): Kinetic characterisation of nucleotide binding to myosin mutants containing a single tryptophan near the active site. XXX European Muscle Conference, Pavia, Italy. J Muscle Res Cell Motil, in press Málnási-Csizmadia, A., Pearson, D S, Kovács, M, Woolley, R J, Geeves, M A, Bagshaw, C R (2002): Direct evidence that the open-closed transition and ATP hydrolysis are separate steps in the myosin mechanism. XXX European Muscle

Conference, Pavia, Italy J Muscle Res Cell Motil, in press Málnási-Csizmadia, A., Woolley, R J, Tóth, J, Nyitray, L, Bagshaw, C R, Kovács, M (2002): Fine tuning of ATP hydrolysis rate by subdomain interactions in myosin. 46th Annual Meeting of the Biophysical Society, San Francisco, CA. Biophys J 82(1): 927 Kovács, M., Málnási-Csizmadia, A, Woolley, J R, Bagshaw, C R (2002): Precise resolution of myosin nucleotide binding process. 46th Annual Meeting of the Biophysical Society, San Francisco, CA Biophys. J 82(1): 1980 97 Doktori értekezés 12 Irodalomjegyzék 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 98 Purich, D. L: Enzyme catalysis: a new definition accounting for noncovalent substrate- and product-like states. Trends Biochem Sci 26, 417 (2001) Holmes, K. C: Muscle contraction Novartis Found Symp 213, 76 (1998) Kühne, W.: Untersuchungen über das Protoplasma und die Contractilitat, Verlag von Wilhelm Engelmann, Leipzig (1864).

Straub, F. B: Actin, Univ Szeged (1943) Lohmann, K.: Darstellung der Adenylpyrophosphatsaure aus Muskulatur Biochem Z 233, 460 (1931). Engelhardt, W. A, and Lyubimova, M N: Myosin and adenosinetriphosphate Nature 144, 668 (1939). Szent-Györgyi, A. G: Meromyosins, the subunits of myosin Arch Biochem Biophys 42, 305 (1953) Margossian, S. S, and Lowey, S: :Substructure of the myosin molecule 3 Preparation of singleheaded derivatives of myosin J Mol Biol 74, 301 (1973) Margossian, S. S, and Lowey, S: Substructure of the myosin molecule IV Interactions of myosin and its subfragments with adenosine triphosphate and F-actin. J Mol Biol 74, 313 (1973) Huxley, H. E: The mechanism of muscular contraction Science 164, 1356 (1969) Huxley, A. F, and Niedergerke, R M: Structural changes in muscle during contraction Interference microscopy of living muscle fibres. Nature 173, 971 (1954) Huxley, A. F, and Simmons, R M: Proposed mechanism of force generation in striated muscle Nature 233, 533 (1971).

Lymn, R. W, and Taylor, E W: Mechanism of adenosine triphosphate hydrolysis by actomyosin. Biochemistry 10, 4617 (1971) Irving, M., Lombardi, V, Piazzesi, G, and Ferenczi, M A: Myosin head movements are synchronous with the elementary force-generating process in muscle. Nature 357, 156 (1992) Huxley, H. E, Simmons, R M, Faruqi, A R, Kress, M, Bordas, J, and Koch, M H: Millisecond time-resolved changes in x-ray reflections from contracting muscle during rapid mechanical transients, recorded using synchrotron radiation. Proc Natl Acad Sci U S A 78, 2297 (1981). Mornet, D., Pantel, P, Audemard, E, and Kassab, R: The limited tryptic cleavage of chymotryptic S-1: an approach to the characterization of the actin site in myosin heads. Biochem Biophys Res Commun 89, 925 (1979). Balint, M., Sreter, F A, Wolf, I, Nagy, B, and Gergely, J: The substructure of heavy meromyosin. The effect of Ca2+ and Mg2+ on the tryptic fragmentation of heavy meromyosin J Biol Chem 250, 6168 (1975).

Malnasi-Csizmadia, A., Hegyi, G, Tolgyesi, F, Szent-Gyorgyi, A G, and Nyitray, L: Fluorescence measurements detect changes in scallop myosin regulatory domain. Eur J Biochem 261, 452 (1999). Malnasi-Csizmadia, A., Shimony, E, Hegyi, G, Szent-Gyorgyi, A G, and Nyitray, L: Dimerization of the head-rod junction of scallop myosin. Biochem Biophys Res Commun 252, 595 (1998). Sata, M., Matsuura, M, and Ikebe, M: Characterization of the motor and enzymatic properties of smooth muscle long S1 and short HMM: role of the two-headed structure on the activity and regulation of the myosin motor. Biochemistry 35, 11113 (1996) Dominguez, R., Freyzon, Y, Trybus, K M, and Cohen, C: Crystal structure of a vertebrate smooth muscle myosin motor domain and its complex with the essential light chain: visualization of the pre-power stroke state. Cell 94, 559 (1998) Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32.

33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. Manstein, D. J, Ruppel, K M, and Spudich, J A: Expression and characterization of a functional myosin head fragment in Dictyostelium discoideum. Science 246, 656 (1989) Ruppel, K. M, Egelhoff, T T, and Spudich, J A: Purification of a functional recombinant myosin fragment from Dictyostelium discoideum. Ann N Y Acad Sci 582, 147 (1990) Egelhoff, T. T, Titus, M A, Manstein, D J, Ruppel, K M, and Spudich, J A: Molecular genetic tools for study of the cytoskeleton in Dictyostelium. Methods Enzymol 196, 319 (1991) Ritchie, M. D, Geeves, M A, Woodward, S K, and Manstein, D J: Kinetic characterization of a cytoplasmic myosin motor domain expressed in Dictyostelium discoideum. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 8619 (1993). Manstein, D. J, Schuster, H P, Morandini, P, and Hunt, D M: Cloning vectors for the production of proteins in Dictyostelium discoideum. Gene 162, 129 (1995) Manstein, D. J, and Hunt, D M: Overexpression of myosin motor domains in

Dictyostelium: screening of transformants and purification of the affinity tagged protein. J Muscle Res Cell Motil 16, 325 (1995). Anson, M., Geeves, M A, Kurzawa, S E, and Manstein, D J: Myosin motors with artificial lever arms. Embo J 15, 6069 (1996) Kliche, W., Fujita-Becker, S, Kollmar, M, Manstein, D J, and Kull, F J: Structure of a genetically engineered molecular motor. Embo J 20, 40 (2001) Suzuki, Y., Yasunaga, T, Ohkura, R, Wakabayashi, T, and Sutoh, K: Swing of the lever arm of a myosin motor at the isomerization and phosphate-release steps. Nature 396, 380 (1998) Shih, W. M, Gryczynski, Z, Lakowicz, J R, and Spudich, J A: A FRET-based sensor reveals large ATP hydrolysis-induced conformational changes and three distinct states of the molecular motor myosin. Cell 102, 683 (2000) Rayment, I., Rypniewski, W R, Schmidt-Base, K, Smith, R, Tomchick, D R, Benning, M M, Winkelmann, D. A, Wesenberg, G, and Holden, H M: Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular

motor. Science 261, 50 (1993) Smith, C. A, and Rayment, I: X-ray structure of the magnesium(II)ADPvanadate complex of the Dictyostelium discoideum myosin motor domain to 1.9 A resolution Biochemistry 35, 5404 (1996). Gulick, A. M, Bauer, C B, Thoden, J B, and Rayment, I: X-ray structures of the MgADP, MgATPgammaS, and MgAMPPNP complexes of the Dictyostelium discoideum myosin motor domain. Biochemistry 36, 11619 (1997) Fisher, A. J, Smith, C A, Thoden, J B, Smith, R, Sutoh, K, Holden, H M, and Rayment, I: X-ray structures of the myosin motor domain of Dictyostelium discoideum complexed with MgADP.BeFx and MgADPAlF4 Biochemistry 34, 8960 (1995) Bauer, C. B, Holden, H M, Thoden, J B, Smith, R, and Rayment, I: X-ray structures of the apo and MgATP-bound states of Dictyostelium discoideum myosin motor domain. J Biol Chem 275, 38494 (2000). Bauer, C. B, Kuhlman, P A, Bagshaw, C R, and Rayment, I: X-ray crystal structure and solution fluorescence characterization of

Mg.2(3)-O-(N-methylanthraniloyl) nucleotides bound to the Dictyostelium discoideum myosin motor domain. J Mol Biol 274, 394 (1997) Houdusse, A., Szent-Gyorgyi, A G, and Cohen, C: Three conformational states of scallop myosin S1. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 11238 (2000) Houdusse, A., Kalabokis, V N, Himmel, D, Szent-Gyorgyi, A G, and Cohen, C: Atomic structure of scallop myosin subfragment S1 complexed with MgADP: a novel conformation of the myosin head. Cell 97, 459 (1999) Smith, C. A, and Rayment, I: X-ray structure of the magnesium(II)-pyrophosphate complex of the truncated head of Dictyostelium discoideum myosin to 2.7 A resolution Biochemistry 34, 8973 (1995). Gulick, A. M, Bauer, C B, Thoden, J B, Pate, E, Yount, R G, and Rayment, I: X-ray structures of the Dictyostelium discoideum myosin motor domain with six non-nucleotide analogs. J Biol Chem 275, 398 (2000) 99 Doktori értekezés 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62.

100 Smith, C. A, and Rayment, I: Active site comparisons highlight structural similarities between myosin and other P-loop proteins. Biophys J 70, 1590 (1996) Bohm, A., Gaudet, R, and Sigler, P B: Structural aspects of heterotrimeric G-protein signaling Curr Opin Biotechnol 8, 480 (1997). Abrahams, J. P, Leslie, A G, Lutter, R, and Walker, J E: Structure at 28 A resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria Nature 370, 621 (1994) Furch, M., Fujita-Becker, S, Geeves, M A, Holmes, K C, and Manstein, D J: Role of the saltbridge between switch-1 and switch-2 of Dictyostelium myosin J Mol Biol 290, 797 (1999) Geeves, M. A, and Holmes, K C: Structural mechanism of muscle contraction Annu Rev Biochem 68, 687 (1999). Sasaki, N., Shimada, T, and Sutoh, K: Mutational analysis of the switch II loop of Dictyostelium myosin II. J Biol Chem 273, 20334 (1998) Kabsch, W., Mannherz, H G, Suck, D, Pai, E F, and Holmes, K C: Atomic structure of the actin:DNase I complex. Nature 347, 37 (1990)

McLaughlin, P. J, Gooch, J T, Mannherz, H G, and Weeds, A G: Structure of gelsolin segment 1-actin complex and the mechanism of filament severing. Nature 364, 685 (1993) Schutt, C. E, Myslik, J C, Rozycki, M D, Goonesekere, N C, and Lindberg, U: The structure of crystalline profilin-beta-actin. Nature 365, 810 (1993) Holmes, K. C, Popp, D, Gebhard, W, and Kabsch, W: Atomic model of the actin filament Nature 347, 44 (1990). Lorenz, M., Poole, K J, Popp, D, Rosenbaum, G, and Holmes, K C: An atomic model of the unregulated thin filament obtained by X-ray fiber diffraction on oriented actin-tropomyosin gels. J Mol Biol 246, 108 (1995). Schroder, R. R, Manstein, D J, Jahn, W, Holden, H, Rayment, I, Holmes, K C, and Spudich, J. A: Three-dimensional atomic model of F-actin decorated with Dictyostelium myosin S1 Nature 364, 171 (1993). Rayment, I., Holden, H M, Whittaker, M, Yohn, C B, Lorenz, M, Holmes, K C, and Milligan, R. A: Structure of the actin-myosin complex and its implications for

muscle contraction. Science 261, 58 (1993) Whittaker, M., Wilson-Kubalek, E M, Smith, J E, Faust, L, Milligan, R A, and Sweeney, H L.: A 35-A movement of smooth muscle myosin on ADP release Nature 378, 748 (1995) Jontes, J. D, Wilson-Kubalek, E M, and Milligan, R A: A 32 degree tail swing in brush border myosin I on ADP release. Nature 378, 751 (1995) Carragher, B. O, Cheng, N, Wang, Z Y, Korn, E D, Reilein, A, Belnap, D M, Hammer, J A., 3rd, and Steven, A C: Structural invariance of constitutively active and inactive mutants of acanthamoeba myosin IC bound to F-actin in the rigor and ADP-bound states. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 15206 (1998). Wells, A. L, Lin, A W, Chen, L Q, Safer, D, Cain, S M, Hasson, T, Carragher, B O, Milligan, R. A, and Sweeney, H L: Myosin VI is an actin-based motor that moves backwards Nature 401, 505 (1999). Volkmann, N., Hanein, D, Ouyang, G, Trybus, K M, DeRosier, D J, and Lowey, S: Evidence for cleft closure in actomyosin upon ADP release. Nat Struct Biol

7, 1147 (2000) Werber, M. M, Szent-Gyorgyi, A G, and Fasman, G D: Fluorescence studies on heavy meromyosin-substrate interaction. Biochemistry 11, 2872 (1972) Bagshaw, C. R, Eccleston, J F, Eckstein, F, Goody, R S, Gutfreund, H, and Trentham, D R: The magnesium ion-dependent adenosine triphosphatase of myosin. Two-step processes of adenosine triphosphate association and adenosine diphosphate dissociation. Biochem J 141, 351 (1974). Johnson, K. A, and Taylor, E W: Intermediate states of subfragment 1 and actosubfragment 1 ATPase: reevaluation of the mechanism. Biochemistry 17, 3432 (1978) Lépésről lépésre – egy molekuláris motor működésének kinetikai megközelítése 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. 82. 83. Trybus, K. M, and Taylor, E W: Transient kinetics of adenosine 5-diphosphate and adenosine 5-(beta, gamma-imidotriphosphate) binding to subfragment 1 and actosubfragment 1. Biochemistry 21, 1284 (1982). Millar, N.

C, Howarth, J V, and Gutfreund, H: A transient kinetic study of enthalpy changes during the reaction of myosin subfragment 1 with ATP. Biochem J 248, 683 (1987) Kurzawa, S. E, Manstein, D J, and Geeves, M A: Dictyostelium discoideum myosin II: characterization of functional myosin motor fragments. Biochemistry 36, 317 (1997) Bagshaw, C. R, and Trentham, D R: The characterization of myosin-product complexes and of product-release steps during the magnesium ion-dependent adenosine triphosphatase reaction. Biochem J 141, 331 (1974). Bagshaw, C. R: Muscle Contraction, Chapman & Hall (1993) Bagshaw, C. R, Trentham, D R, Wolcott, R G, and Boyer, P D: Oxygen exchange in the gamma-phosphoryl group of protein-bound ATP during Mg2+-dependent adenosine triphosphatase activity of myosin. Proc Natl Acad Sci U S A 72, 2592 (1975) Trentham, D. R, Eccleston, J F, and Bagshaw, C R: Kinetic analysis of ATPase mechanisms Q Rev Biophys 9, 217 (1976). Uyeda, T. Q, Abramson, P D, and Spudich, J A: The

neck region of the myosin motor domain acts as a lever arm to generate movement. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 4459 (1996) Warshaw, D. M, Guilford, W H, Freyzon, Y, Krementsova, E, Palmiter, K A, Tyska, M J, Baker, J. E, and Trybus, K M: The light chain binding domain of expressed smooth muscle heavy meromyosin acts as a mechanical lever. J Biol Chem 275, 37167 (2000) Gulick, A. M, and Rayment, I: Structural studies on myosin II: communication between distant protein domains. Bioessays 19, 561 (1997) Wells, J. A, and Yount, R G: Reaction of 5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) with myosin subfragment one: evidence for formation of a single protein disulfide with trapping of metal nucleotide at the active site. Biochemistry 19, 1711 (1980) Nitao, L. K, and Reisler, E: Probing the conformational states of the SH1-SH2 helix in myosin: a cross-linking approach. Biochemistry 37, 16704 (1998) Berger, C. L, Craik, J S, Trentham, D R, Corrie, J E, and Goldman, Y E: Fluorescence polarization from

isomers of tetramethylrhodamine at SH-1 in rabbit psoas muscle fibers. Biophys J 68, 78S (1995). Thomas, D. D, Ramachandran, S, Roopnarine, O, Hayden, D W, and Ostap, E M: The mechanism of force generation in myosin: a disorder-to-order transition, coupled to internal structural changes. Biophys J 68, 135S (1995) Houdusse, A., and Sweeney, H L: Myosin motors: missing structures and hidden springs Curr Opin Struct Biol 11, 182 (2001). Kitamura, K., Tokunaga, M, Iwane, A H, and Yanagida, T: A single myosin head moves along an actin filament with regular steps of 5.3 nanometres Nature 397, 129 (1999) Tanaka, H., Homma, K, Iwane, A H, Katayama, E, Ikebe, R, Saito, J, Yanagida, T, and Ikebe, M.: The motor domain determines the large step of myosin-V Nature 415, 192 (2002) Malnasi-Csizmadia, A., Woolley, R J, and Bagshaw, C R: Resolution of conformational states of Dictyostelium myosin II motor domain using tryptophan (W501) mutants: implications for the open-closed transition identified by

crystallography. Biochemistry 39, 16135 (2000) Sambrook, J., Fritsch, E F, and Maniatis, T: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989). Laemmli, U. K: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680 (1970) Trentham, D. R, Bardsley, R G, Eccleston, J F, and Weeds, A G: Elementary processes of the magnesium ion-dependent adenosine triphosphatase activity of heavy meromyosin. A transient kinetic approach to the study of kinases and adenosine triphosphatases and a colorimetric inorganic phosphate assay in situ. Biochem J 126, 635 (1972) 101 Doktori értekezés 84. 85. 86. 87. 88. 89. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. 97. 98. 99. 100. 101. 102. 103. 104. 105. 102 Lakowicz, J. R: Principles of Fluorescence Spectroscopy, Kluwer Academic Publishers, Norvell, MA (1999). Peterman, B. F: Measurement of the dead time of a fluorescence stopped-flow instrument Anal Biochem 93, 442

(1979). Clegg, R. M, and Maxfeld, B W: Rev Sci Instrum 47, 1383 (1976) Kuhlman, P. A, and Bagshaw, C R: ATPase kinetics of the Dictyostelium discoideum myosin II motor domain. J Muscle Res Cell Motil 19, 491 (1998) Hiratsuka, T.: Spatial proximity of ATP-sensitive tryptophanyl residue(s) and Cys-697 in myosin ATPase. J Biol Chem 267, 14949 (1992) Park, S., and Burghardt, T P: Isolating and localizing ATP-sensitive tryptophan emission in skeletal myosin subfragment 1. Biochemistry 39, 11732 (2000) Yengo, C. M, Chrin, L R, Rovner, A S, and Berger, C L: Tryptophan 512 is sensitive to conformational changes in the rigid relay loop of smooth muscle myosin during the MgATPase cycle. J Biol Chem 275, 25481 (2000) Batra, R., and Manstein, D J: Functional characterisation of Dictyostelium myosin II with conserved tryptophanyl residue 501 mutated to tyrosine. Biol Chem 380, 1017 (1999) Sellers, J. R: Myosins, Oxford University Press, Oxford (1999) Torgerson, P. M: Tryptophan emission from myosin

subfragment 1: acrylamide and nucleotide effect monitored by decay-associated spectra. Biochemistry 23, 3002 (1984) Lakowicz, J. R, and Gryczynski, I: Tryptophan fluorescence intensity and anisotropy decays of human serum albumin resulting from one-photon and two-photon excitation. Biophys Chem 45, 1 (1992). Park, S., and Burghardt, T P: Tyrosine mediated tryptophan ATP sensitivity in skeletal myosin Biochemistry 41, 1436 (2002). Shih, W. M, and Spudich, J A: The myosin relay helix to converter interface remains intact throughout the actomyosin ATPase cycle. J Biol Chem 276, 19491 (2001) Walmsley, A. R, and Bagshaw, C R: Logarithmic timebase for stopped-flow data acquisition and analysis. Anal Biochem 176, 313 (1989) Bagshaw, C. R: The kinetic mechanism of the manganous ion-dependent adenosine triphosphatase of myosin subfragment 1. FEBS Lett 58, 197 (1975) Millar, N. C, and Geeves, M A: Protein fluorescence changes associated with ATP and adenosine 5-[gamma-thio]triphosphate binding

to skeletal muscle myosin subfragment 1 and actomyosin subfragment 1. Biochem J 249, 735 (1988) Kodama, T.: Thermodynamic analysis of muscle ATPase mechanisms Physiol Rev 65, 467 (1985) Peyser, Y. M, Ajtai, K, Burghardt, T P, and Muhlrad, A: Effect of ionic strength on the conformation of myosin subfragment 1-nucleotide complexes. Biophys J 81, 1101 (2001) Urbanke, C., and Wray, J: A fluorescence temperature-jump study of conformational transitions in myosin subfragment 1. Biochem J 358, 165 (2001) Muhlrad, A.: Studies on the amino groups of myosin ATPase III Effect of nucleotides on the fluorescence of beta-naphthoquinone-4-sulfonate bound to amino groups of myosin. Biochim Biophys Acta 490, 79 (1977). Ajtai, K., Peyser, Y M, Park, S, Burghardt, T P, and Muhlrad, A: Trinitrophenylated reactive lysine residue in myosin detects lever arm movement during the consecutive steps of ATP hydrolysis. Biochemistry 38, 6428 (1999) Sleep, J. A, Trybus, K M, Johnson, K A, and Taylor, E W: Kinetic

studies of normal and modified heavy meromyosin and subfragment 1. J Muscle Res Cell Motil 2, 373 (1981) Izoforma Fésűskagyló S1 Csirke vázizom S1 NYITOTT (open) Rigor-szerű (near-rigor) „Lecsapott” (down) ligand PDB MMDB apo 1DFK 14772 apo (SO42-) 2MYS 5275 ref. (38) (32) Csirke simaizom MDE Csirke simaizom MD Dictyostelium MD apo MgATP MgADP MgAMPPNP MgADP.BeF3 mant-ADP.BeF3 MgATPγS MgPPi nanológoka Dictyostelium MD + mesterséges erőkar 1. táblázat MgADP 1FMV 14529 1FMW 14530 1MMA 6921 1MMN 6858 1MMD 4844 1LVK 7083 1MMG 6922 1MNE 4842 1D0X, 1D0Y, 1D0Z, 124441D1A, 12449 1D1B, 1D1C (36) (36) (34) (34) (35) (37) (34) (40) 1G8X (29) 15442 ZÁRT (closed) Átmeneti (transition) „Felhúzott” (primed, up) ligand PDB MMDB MgADP.Vi 1DFL 14773 MgADP.BeF3 MgADP.AlF4 MgADP.AlF4 MgADP.Vi MgADP.AlF4 1BR4 1BR1 1BR2 1VOM 1MND 10681 10679 10680 5405 4843 „Levált” (detached) ref. (38) ligand MgADP PDB 1B7T MMDB 10192 ref. (39) (21) (21) (21) (33) (35)

(41) A miozin fej publikált kristályszerkezetei a dinitrofenilaminoetil-, dinitrofenilaminopropil-, o-nitrofenilaminoetil-, m-nitrofenilaminoetil-, p-nitrofenilaminoetil-, illetve o-nitrofenil-N-metil-aminoetil-difoszfát- berillium fluorid Mutagenezis módja Használt oligonukleotidok Leírás W501+ (ref. 80) Egyetlen triptofán a relé-konverter régióban („ATP-szenzitív triptofán”) W36F, W432F, W584F pDXA/M761 GeneEditor (Promega) W- (ref. 80) Triptofán-mentes W36F, W432F, W501F, W584F pDXA/W501+ GeneEditor (Promega) W113+ Egyetlen triptofán a nukleotid kötőhelynél (vázizom W113-mal homológ pozícióban) W36F, W432F, W501F, W584F, D113W pDXA/W- PCR kazettacsere (KpnI – EcoRI) Egyetlen triptofán a nukleotid kötőhelynél (F129 konzervatív szubsztitúciója) Egyetlen triptofán a nukleotid kötőhelynél (vázizom W131-gyel homológ pozícióban) Két triptofán: egy a nukleotid kötőhelynél, a másik a relékonverter régióban K84E

mutáció (N-term. szubdomén – konverter kölcsönhatási felszín) W501+ motor doménben K84M mutáció (N-term. szubdomén – konverter kölcsönhatási felszín) W501+ motor doménben R704E mutáció (N-term. szubdomén – konverter kölcsönhatási felszín) W501+ motor doménben K84E és R704E mutációk (Nterm. szubdomén – konverter kölcsönhatási felszín) W501+ motor doménben W36F, W432F, W501F, W584F, F129W pDXA/W- PCR kazettacsere (KpnI – EcoRI) 5’ oligo: MDup 3’ oligo: TGGAATTCTCTTCCATGGATTGACGGCAACC (F129W) W36F, W432F, W501F, W584F, R131W pDXA/W- PCR kazettacsere (KpnI – SmlI) 5’ oligo: MDup 3’ oligo: ATCAACCATCTCTTGAGTGTAGATTGGAATCCA CTTGAATGGATTGACGGC (R131W) W36F, W432F, W584F, F129W pDXA/W501+ PCR kazettacsere (KpnI – EcoRI) 5’ oligo: MDup 3’ oligo: TGGAATTCTCTTCCATGGATTGACGGCAACC (F129W) W36F, W432F, W584F, K84E pDXA/W501+ PCR kazettacsere (BsaBI – EcoRI) 5’ oligo: TCAAAAAGGATGATGCCAATCAACGTAATCC AATCGAGTTCGATGGTGTCG

(K84E) 3’ oligo: GATTGGAATTCTCTTGAATGGATTGACGGC (EcoDown) W36F, W432F, W584F, K84M pDXA/W501+ PCR kazettacsere (BsaBI – EcoRI) 5’ oligo: TCAAAAAGGATGATGCCAATCAACGTAATCCA ATCATGTTCGATGGTGTCG (K84M) 3’ oligo: EcoDown W36F, W432F, W584F, R704E pDXA/W501+ PCR kazettacsere (Bgl II – BpiI) 5’ oligo: CAACAAGATCTCGAACTTTGCTTC (Seq5) 3’ oligo: ATCGGTGGCTTTTTGTGAGTCTTCAGCGTCTC TTGGAACGTTTGGAGCTAATAAATAGTATTCTTTGACGAA ATCGGC (R704E) W36F, W432F, W584F, K84E, R704E pDXA/W501+/ K84E, pDXA/W501+/ R704E Kazettacsere (Bgl II) W129+ W131+ W129+/W501+ W501+/K84E W501+/K84M W501+/R704E W501+/K84ER704E Mutációk Kiindulási plazmid Név 2. táblázat Mutáns DNS konstrukciók leírása és elkészítésének módja (mutáns tripletek aláhúzással jelölve) GAGATACATTTTCTATAATCCAGATCC (W36F) CGTCTTTTCCTCTTCTTGGTCAAAAAGATCAACAATGTCC (W432F) GAGATTCAAGATTTCTTAGAAAAGAACAAAGATCC (W584F) GAAGAATATCTTAAAGAGAAAATCAATTTCACTTTCATCG ATTTTGGTC (W501F) 5’ oligo:

ATGGATGGTACCGAGGATCCAATTCATG (MDup) 3’ oligo: GATTGGAATTCTCTTGAATGGATTGACGGCAA CCAAAAAGAGACCTGAATAGGTGTAAATTAACCATTGATT GTAAGCAACACGG (D113W) Fluor. Mutáns Ligand intenzitása apo Fluor. változás (%)b 1,00 +85 ADP -18 ADP. AlF4 +88 W501+ W129+ W129+/ W501+ -4 (ref. 80) -7 (ref. 80) 0,56 0,095 0,047 4,18 (ref. 80) 2,72 (ref. 80) 3,10 (ref. 80) 0,095 rss r0 φ (ns) τ1 (ns) Életidőkomponensek (%) τ2 (ns) τ1 τ2 statikus 0,21 0,209 59 ± 4 1,00 4,92 12 17 71 0,22 0,191 59 ± 2 1,11 4,78 10 30 60 0,21 0,194 54 ± 2 0,91 4,74 11 13 76 0,22 0,203 68 ± 4 1,37 4,82 10 30 60 0,056 3,86 0,20 0,167 120 ± 9 0,93 5,00 14 16 70 -57 -7 0,021 1,80 0,21 0,205 169 ± 24 0,75 4,74 8 6 86 ADP -55 -7 0,026 1,52 0,21 0,191 118 ± 14 0,71 4,66 9 7 84 PPi +57 +4 0,45 0,029 0,18 ATP -32 -6 0,016 0,20 ADP -31 -6 0,016 0,20 ATP +5 +3 ADP +3 +1 ATP +50 ADP -30 apo W113+ -7 (ref.

80) Ksv (M-1)c ATP apo W131+ Q 0,058 ATP apo Eltolódás (nm)b 0,72 3. táblázat A motor domén konstrukciók fluoreszcencia-emissziójának adatai Q: kvantumhatásfok, KSV: Stern-Volmer állandó, rss: steady-state anizotrópia, r0: a lecsengési görbéből t = 0 időpontra extrapolált anizotrópia, φ: anizotrópialecsengési idő, τ: életidő a apo állapotban, W501+ -hoz képest apo állapothoz képest c akrilamiddal b Paraméter app app Koc [=K3a(1+K3b)] app app Koc (=K3a) Koc (=K3a) Koc [=K3a(1+K3b)] K3a ∆Go (nyitott-zárt) ∆Ho (nyitott-zárt) k+3a k-3a Ligand AMP.PNP ADP.BeFx ATP AMP.PNP ADP.BeFx ATP ATP AMP.PNP ADP.BeFx ATP AMP.PNP ADP.BeFx ATP AMP.PNP ADP.BeFx ATP AMP.PNP ADP.BeFx ATP K3b ATP k+3b k-3b Melyik mérésből Számítás módja app Steady-state fluoreszcencia hőfüggése Nyomásugrásos tranziens amplitúdója Mértékegység Koc = (F-Fo)/(Fc-F) - app Koc = 1 az amplitúdó maximális értékénél Megállított

áramlásos mérésben a kezdeti gyors változás amplitúdója Steady-state fluoreszcencia hőfüggése ∆Go = -RTlnappKoc Steady-state fluoreszcencia hőfüggése van’t Hoff-ábrázolás (lnappKoc vs 1/T) meredekségéből (-∆Ho/R) Nyomásugrásos tranziens megfigyelt sebességi állandója (kobs) kobs = k+3a+k-3a K3a = k+3a/k-3a kJ/mol s-1 Érték o 15 oC 0,49 0,85 14 0,32 1,0 4,6 0,3 1,7 0,38 -6,4 68 78 96 210 180 150 420 140 490 20 oC 0,82 1,43 32 1 2,3 5,7 0,4 0,49 -0,87 -8,4 66 60 114 460 250 350 570 170 870 14 45 79 8 14 13 5C 0,11 0,20 3 <0,1 0,43 1,9 0,2 5,2 3,8 -2,6 132 133 117 30 54 150 270 Steady-state fluoreszcencia hőfüggése (appKoc), megállított áramlásos mérés (K3a) Nyomásugrásos tranziens amplitúdója (appKoc), megállított áramlásos mérés (K3a) Megállított áramlásos mérés (kobs, K3a) K3b: lásd fentebb K3b = (appKoc/K3a)-1 k+3b = kobs/{[K3a/(1+K3a)]+1/K3b} 10 C 0,25 0,46 7 0,16 0,55 3,3 1,8 -4,4 96 94 92 92 70 370

150 25 oC 1,06 1,74 45 1 2,6 -0,14 -1,4 -9,4 60 58 82 1000 370 950 210 - -1 s k-3b = k+3b/K3b o 1720 1,22,5 53-63 1,24,5 90110 1,18,5 4. táblázat A nyitott-zárt átmenet és az ATP-hidrolízis lépés kinetikai és termodinamikai paraméterei a W501+ motor doménen végzett kísérletek alapján Paraméter ATP AMP.PNP W501+ W501+/K84M W501+/R704E W501+ ∆Go (10oC) (kJ/mol) -0.90 -1.41 1.63 6.49 ∆Go (15oC) (kJ/mol) -1.92 -3.13 0.31 ∆Go (20oC) (kJ/mol) -3.03 -5.06 ∆Go (25oC) (kJ/mol) -3.59 ∆Ho (kJ/mol) 63 ADP.BeFx W501+/K84M W501+/R704E W501+ W501+/K84M W501+/R704E 6.39 3.37 3.50 4.20 4.99 5.03 2.03 2.43 3.78 -1.02 3.76 3.83 7.28 0.95 1.38 2.57 -6.85 -2.05 2.70 2.70 5.92 0.00 0.62 1.95 106 78 79 75 95 72 63 47 5. táblázat A nyitott-zárt egyensúly termodinamikai paraméterei a W501+, W501+/K84M és W501+/R704E mutánsok steady-state fluoreszcenciájának hőmérsékletfüggése alapján (A

paraméterek számításának módját lásd a 4. táblázatban)