Biológia | Tanulmányok, esszék » Halembriológia, zebrahal

Halfejlõdés http://zfin.org/zf info/zfbook/stages/indexhtml Zebrahal HALEMBRIOLÓGIA Zebrahal (Zebrafish, Danio (Brachidanio) rerio) Petesejt Az érett petesejt (ovum) a fejlődés kezdeti lépéseihez szükséges anyagok mindegyikét tartalmazza. Citoplazmáját a hímivarsejt plazmamembránjával fúzionálni képes sejtmembrán, valamint a spermiumkötő receptorai révén fajspecifikus megtermékenyítést biztosító szikmembrán (membrana vitellina) veszi körül. A csontoshalak petesejtje polarizált: a nagymennyiségű szikanyag túlnyomó része a vegetatív póluson koncentrálódik, míg a sejtmagot is tartalmazó, szikben szegény citoplazma az animalis póluson helyezkedik el (poly-telolecithalis pete). A szikanyag mennyisége és elhelyezkedése a későbbi barázdálódás szempontjából fontos, mivel annak típusát – a blastomerák méretét és osztódásuk ütemét – határozza meg (a magosztódást követő membránszintézis sebessége a szikben gazdag

vegetatív póluson elmarad az animális pólushoz képest). Azon petesejtek, amelyek nagymennyiségű szikanyagot tartalmaznak, ráadásul ez a sejt egyik pólusán koncentrálódik, ún. meroblasticus barázdálódáson mennek át: ennek során segregatio csak az animális, szikben szegény citoplazma területén zajlik. Zigóta (0–45 perc) E periódus a megtermékenyítéstől az azt kb. 40 perc múlva követő első osztódásig tart A megtermékenyítés speciális citoplazma mozgásokat indukál: a szikmentes citoplazma méginkább az animális pólus felé mozdul, kiemelve ezzel a csírakorongot (blastodiscus) a szikben gazdag vegetatív citoplazma felszínéről (1.ábra, “1 cell”; 2A ábra) A csírakorong, felülnézetben, elliptikus: megkülönböztethető egy, az állat leendő hossztengelyével párhuzamos hosszabb, valamint egy erre merőleges rövidebb tengelye. 1 Halfejlõdés http://zfin.org/zf info/zfbook/stages/indexhtml Zebrahal Barázdálódás (45

perc–2,2 óra) A citoplazma osztódásai meroblasticusak: az osztódási síkok csak a csírakorong területét osztják blastomerákra, s kezdetben ez utóbbiak citoplazmahidakon keresztül kapcsolatban maradnak a szikben gazdag vegetatív pólus citoplazmaállományával. Az első osztódás síkja verticalis: az osztódási barázda a csírakorong hossztengelyére merőlegesen az animális póluson jelenik meg, majd gyorsan terjed a vegetatív pólus felé. Eredményeképpen két egyenlő méretű blastomera alakul ki – az osztódás tehát incomplet, verticalis, equalis (1.ábra, “2 cells”; 2B ábra). A második osztódás síkja az elsőre merőleges, így a csírakorong hossztengelyébe esik, s négy egyenlő méretű blastomerát eredményez (1.ábra, “4 cells; 2C ábra) A harmadik sejtciklusban a négy sejt mindegyike osztódik, mégpedig az első osztódási síknak megfelelően: az osztódási barázda a hossztengelyre merőlegesen, az első osztódás síkjának

mindkét oldalán megjelenik. Eredménye 2x4 blastomera (1ábra, “8 cells”; 2D ábra) A negyedik osztódás a 8 sejtet a második síkjával, azaz a hossztengellyel párhuzamosan osztja 2–2 egyenlő részre. A sejtek elrendeződése ezután 4x4, tehát felülnézetben 4 centralis sejtet 12 marginalis vesz körül. A centralis sejtek ekkor elvesztik az őket a vegetatív citoplazmával összekötő citoplazmahídjaikat, azaz e sejtek lesznek az elsők, amelyeket minden oldalon teljes plazmamembrán határol. Ezzel szemben a marginális sejtek továbbra is megőrzik citoplazmakapcsolatukat az alattuk lévő, szikben gazdag citoplazmával (1.ábra, “16 cells”; 2E ábra) Az ötödik sejtciklus 32 sejtet eredményez 4x8-as mintázatban (1.ábra, “32 cells”; 2F ábra) A hatodik osztódás síkja az előzőektől eltérően nem verticalis, hanem horizontális, azaz a felszínnel párhuzamos. Eredményeképpen a 64 sejt két sejtrétegbe rendeződik: a mélyebben fekvő sejtek

(deep cells) fölött azokat beborító, burkoló sejtek (enveloping cells, “EVL”) helyezkednek el (1.ábra, “64 cells”). (Az embriót a mélyebben fekvő sejtek és utódaik alkotják majd) Blastula stádium (2 1/4 – 5 1/4 óra) Ez a periódus a 8-dik osztódási ciklussal, 128 sejtes állapottal kezdődik, s a kb. 14-dik ciklusnál kezdődő gastrulatioval ér véget. Mivel a fejlődés során blastocoel – azaz üreg – nem jelenik meg, helyesebb stereoblastuláról beszélni: a mélyben elhelyezkedő sejtek (deep cells) között ugyanis csupán szabálytalan, extracelluláris 2 Halfejlõdés http://zfin.org/zf info/zfbook/stages/indexhtml Zebrahal üregrendszer látható. Az osztódások síkja kevésbé meghatározott mint az előző állapotban, s a szinkronizált osztódások aszinkronná válnak. A 10-dik osztódás kezdetén a marginális sejtek citoplazmájukat és magjaikat az alattuk lévő, szikben gazdag citoplazmába bocsátják, s ezért

alacsonyabbakká válnak. Az így kialakuló, magokat tartalmazó, kezdetben gyűrű alakú citoplazma a szik syntytialis réteg (yolk syntytial layer, “YSL”, 1.ábra, “1k cell”). Az YSL kialakulása után azon EVL sejtek, amelyek eddig a második gyűrűt alkották a csírakorong peremén, most marginális pozícióba kerülnek: mivel azonban e sejtek már nem rendelkeznek citoplazmahidakkal, ettől kezdve a csírakorong minden sejtjét teljes plazmamembránnal határolja. Az YSL sejtmagok ugyan osztódnak, de e magosztódásokat nem követi membránszintézis, s a sziket tartalmazó citoplazma syntytialis marad (1.ábra, “high–oblong”) Az YSL a csontoshalak specialitása: mindvégig extraembrionális marad, tehát nem vesz részt az embrió szöveteinek kialakításában. Kezdetben gyűrűt alkot, ám hamarosan behúzódik a csírakorong centralis területei alá is, kialakítva a nutritív funkcióval rendelkező belső syntytiumot (internal YSL, “IYSL”), amely az

embryogenezis végéig megmarad. Az YSL külső szegélye (extarnal YSL, “E-YSL”) desmosomákkal szorosan hozzákapcsolódik a felette lévő marginalis sejtcsoporthoz, s így a későbbiekben az epibólia frontvonalába kerül majd. Az epibólia során mind az YSL, mind pedig a csírakorong körülnőni igyekszik a szikanyagot. Kezdeti lépéseként a legmélyebben fekvő blastomerák (deepest blastomers, “DEL cells”) a fölöttük lévő sejtek közé furakodva elindulnak a felszín felé – a csírakorong vastagsága tehát csökken (1.ábra, “dome”, 30% epibólia). Ez, a radiális intercalationak nevezett aktív sejtátrendeződés vezeti be és indukálja az epibóliaként megjelenő sejtvándorlást. A “tülekedés” eredményeként a marginális sejtek – az alattuk lévő, s hozzájuk desmosomákkal kapcsolódó E-YSL réteggel együtt – egyre jobban eltávolodnak a csírakorong központjától, s elkezdik körülölelni a szikanyagot. Mindeközben az EVL

egyrétegű marad A syncytialis sziksejt alakja jelentősen megváltozik: a belső YSL (I-YSL), elfoglalva a felszín felé elmozdult DEL sejtek helyét, kiboltosodik, míg a külső YSL gyűrűjének átmérője megnő, hiszen körülfogni igyekszik a szikanyagot (1.ábra, dome–30% epiboly) (Megjegyzendő, hogy az epibólia a korán aktiválódó zigotikus gének kontrollja alatt áll!) 3 Halfejlõdés http://zfin.org/zf info/zfbook/stages/indexhtml Zebrahal Gastrula állapot (5 ¼–10 óra) A gastruláció során az epibólia folytatódik, ám ezen közben morfogenetikus sejtmozgások kialakítják a csíralemezeket, valamint az embrionális tengelyeket. 50%-os epibóliánál a csírakorong széle (az itt felszaporodó sejtek miatt) megvastagodik, s kialakul a csíraöv (e peremet az angol nyelvű irodalom germ ring-nek nevezi, lsd. 1 ábra, girmring) A vándorló sejtek jelentős része e szegély egyetlen pontja felé tart, s így annak közelében összegyűlve a

lokális megvastagodásként megjelenő embriópajzsot (embrionic shield) alkotja, amely kijelöli az embrió dorsalis oldalát (1.ábra, shield) Mivel az embriónak nem volt blastocoelje, a gastrulának sem lesz ősbélürege1 és a külvilágból ebbe vezető, hagyományos értelemben vett ősszájnyílása (blasto- vagy gastroporus) sem; a csírakorong szélére érkező, s a girm ring mentén mélybe forduló DEL sejtek azonban jezik az ősszájnyílás funkciójával rendelkező területeket. A csírakorong peremén a blastoderma önmaga alá fordulva kettőzetet alkot: a felső az epiblast, amely folyamatosan szolgáltatja az alsó réteg, azaz a hypoblast sejtjeit (1.ábra, 8h, 4ábra) E két réteg között csupán egy keskeny hasadék (Brachet’s cleft) látható, amelynek azonban nagyon fontos szerepe van: megakadályozza, hogy az epi- és hypoblast sejtek elhagyják saját rétegüket, s keveredjenek. A két sejtrétegben eltérő irányban vándorolnak a sejtek: a dorsalis

régió (embriópajzs) kivételével az epiblast sejtek a csírakorong pereme felé haladnak, ott a mélybe fordulnak, majd a hypoblast rétegben a peremtől elvándorolnak. Azon sejtek, amelyek az epiblast rétegében maradnak, az ectodermát alkotják, s a későbbiekben az epidermist, az idegrendszert, a dúclécet, valamint az érzékszervi placodokat fogják alkotni. A hypoblast sejtek a mesodermát, valamint az endodermát szolgáltatják (lsd. sorstérkép, 3ábra) (A hypoblat csupán egy-két sejtréteg vastagságú az embrió egész területén, s jelenleg nem ismert, hogyan különül e két utóbb említett csíralemezre.) Az EVL sejtek nem osztódnak, s nem is vándorolnak – e helyett az egész embriót beburkoló, védő funkciójú peridermat hozák létre, amelynek egyetlen rétegében nagyon lapos sejtek láthatók. Az embriópajzs a DEL sejtek tömörülése (4.ábra) Azon sejtek, amelyek itt fordulnak a mélybe, az ún. axialis hypoblastot alkotják: előre, a feji

vég felé vándorolnak, s a praechordalis lemez, valamint a 1 a blastocoel a későbbi sejtvándorlások, egyúttal az archenteron számára biztosít teret az embrióban 4 Halfejlõdés http://zfin.org/zf info/zfbook/stages/indexhtml Zebrahal chorda mesoderma alkotói lesznek. A praechordalis lemezből differenciálódik majd a kikelési mirigy (hatching gland), valamint a garat endodermalis hámja, a praechordalis lemezt követő chorda mesoderma pedig a gerinchúr előfutára lesz. A blastoderma szélén, azaz a germ ring területén – lassabban ugyan, mint az embriópajzs területén, de – mindenhol zajlik sejtbevándorlás. Azon hypoblast sejtek, amelyek itt fordulnak a mélybe, a paraaxialis hypoblastot alkotják, amelynek rétege a középsík felé nyomulva megközelíti az axialis hypoblastot. A paraaxialis hypoblast elülső (anterior) területének sejtjei a fej izomzatát (szemmozgató izmok, zsigerívek izmai), míg az őket caudalisan követők az

őscsigolyák (somiták) szegmentálódó állományat fogják adni (3. ábra) Az epibolia előrehaladtával az embriópajzs az animalis pólus felé terjeszkedik, s feltűnővé válik, hogy a dorsalis oldalon vastagabb, mint a ventralis oldalon. Ez az eltérés az axialis mesoderma jelenlétével magyarázható. A gastrulatio felénél az axiális és a mellette húzódó paraaxialis hypoblast egyre inkább elkülönül, mivel az utóbbi a középsík mindkét oldalán ellaposodik. A gastrulatio végén a dorsalis epiblast (ectoderma) a neurulatio kezdetét jelezve vastagabbá válik, s az axialis hypoblast fölött megjelenik a velőlemez. 90%-os epiboliánál a vegetatív pólus szomszédságában már csak egy kis részen, a szikdugó területén marad fedetlen a sziktömeg (1.ábra, 9h) A gastrula állapot végén, amikor az epibolia befejeződik, az embrió hossztengelyében megjelenik a farokbimbó (1.ábra, 10, 11h) Segmentatios periódus (10–24 óra) E stádium során igen

sok morfogenetikus lépés zajlik: megjelennek a somiták, láthatóvá válnak az első szervtelepek, az embrió hosszának növekedésével a farokbimbó egyre feltűnőbbé válik, s megjelennek az első, bár még koordinálatlan mozgások is. Az állatka körülöleli a hajdani vegetatív pólust is, így farokbimbója egyre inkább a feje felé irányul (1.ábra, 14, 16, 18h) Az őscsigolyák egymás után jelennek meg a törzs, valamint a farok terülerén (1.ábra, 12–18h) Egyik, természetesen szelvényenként ismétlődő sejtcsoportjuk a törzs- és farokizomzatot kialakító myotom (más néven myomer, 3.ábra) A belőlük fejlődő myoblastok izomszekrényeket hoznak létre, amelyek között transversalis lefutású kötőszövetes lemezek, myoseptumok jelennek meg. A csigolyaporcokat adó, s szintén szelvényesen felsorakozó sclerotom sejtjei – fiatal somitában – ventromedialis helyzetűek. A későbbiekben mesenchymatikussá válnak és dorsalis irányba

vándorolva felsorakoznak a myotom és a gerinchúr közötti területen. 5 Halfejlõdés http://zfin.org/zf info/zfbook/stages/indexhtml Zebrahal Általában a gerinces embriók somitáiban még egy harmadik sejtcsoport, a bőr kötőszövetes rétegeit (cutis, subcutis) adó dermatom is elkülönül. Zebrahal esetében azonban nem tisztázott, hogy ennek sejtjei is az őscsigolyából származnak-e. A gerinchúr antero-posterior irányban differenciálódik: belső sejtjei vacuolizálódnak, a felszíniek pedig kezdetben egy sejtréteget alkotva körülveszik őket, majd a későbbiekben a gerinchúr kötőszövetes tokját létrehozó sejtekké fejlődnek. A most már csak ectodermalis sejtek által alkotott epiblast intenzív fejlődésen megy át. Ekkor a – velőlemezként megjelenő – központi idegrendszer kezdeménye már jól láthatóan jelen van. Ez annak köszönhető, hogy a neuralis ectoderma területén a köbhámsejtek hengerhámsejtekké differenciálódnak,

s így kimagasodnak az eretei alakjukat megőrző epidermalis ectoderma sejteinek környezetéből (5.ábra) A primordium ezután lefűződik, s a mélybe süllyedve kezdetben egy tömör (!) neuralis pálcát (neural rod) alkot. Ürege (neurocoel, a későbbi canalis centralis és az agyhólyagok üregrendszere) csak ezt követően alalkul ki a sejtek apicalis felszíneinek egymástól való eltávolodása révén. A neurulatio ezen, csontoshalakra jellemző formáját secunder naurulationak nevezik, szemben a más gerinces osztályokban leírt primaer neurulatioval, ahol a neurocoel a velőlemez lefűződésekor, pontosabban a velősáncok záródásakor formálódik meg. Az agyhólyagok differenciálódása már a neurocoel megjelenése előtt megindul. A neurális pálca cranialis része a szegmentációs periódus elején ugyan vastagabb, mint a leendő gerincvelői területen, ám tagolatlan (6.A ábra) 10, egymástól jól elkülönülő tágulata (neuromer) jelenik meg (6B

ábra): az első három a prosencephalicus agyhólyagból fejlődő telencephalon és diencephalon, valamint a mesencephalicus eredetű mesencephalon. A további 7 (rhombomerák) a rhombencephalon területén a formálódó medulla oblongatat alkotja. A diencephalonból differenciálódó szemhólyagok a periódus elején, a nyúltvelőhőz kapcsolódó kisagy (cerebellum) pedig a végén jelennek meg (6.C ábra, 1ábra, 22h) . A stádium végét az agykoponya alatt elhelyezkedő, arckoponyát alkotó szigerívek megjelenése jelzi. A zsigerívek kialakulásásnak stádiuma (Pharyngula period, 24–48 óra) Az e stádiumba lépő embriók bilaterális szimmetriával, jól fejlett gerinchúrral, teljes somitaszámmal, s intenzíven fejlődő idegrendszerrel rendelkeznek. A periódus neve arra utal, hogy ezen időszak egyik 6 Halfejlõdés http://zfin.org/zf info/zfbook/stages/indexhtml Zebrahal legfeltűnőbb eseménye a zsigerívek megjelenése és fejlődése: 7 zsigerív

kezdemény alakul ki, amelyek közül a második és a harmadik közötti határ a legszembetűnőbb. Az első, a mandibularis (állkapcsi), a második a hyoid (nyelvcsonti) ív; a 3–6-dik ívekből a kopolyúk fejlődnek, míg a 7-dikből a garatfogakat viselő garatcsontok alakulnak ki (1.ábra: 31–42h) Mesenchymalis sejtek tömörülésével megformálódnak az úszóbimbók (1.ábra, 48h) Megjelennek a pigmentsejtek egyrészt a retinában, másrészt a bőrben (ide dúcléc eredetű melanocyták vándorolnak be). Kirajzolódik a keringési rendszer (1.ábra, 31–48h): a szív dobogni kezd, s ürege egyre jobban tagolódik. A véráramlás megindul, megjelennek a páros aortaívek – az első a legkorábban, a többi öt a stádium vége felé. A szegmentációs periódus végén, az egyes myotomok mozgása még koordinálatlan. A zsigerívek kialakulásának idején azonban az embrió mozgásai ritmikus úszómozgássá szerveződnek, s a kishal érintésre érzékennyé

válik. Kikelési periódus (48–72 óra) Az állkapocs és a száj régió jelentős változáson megy át. A periódus elején jelentős mesenchymalis sejtcsoportosulások figyelhetők meg a mandibularis és a hyoid ív területén, s ezekből a stádium végére porctelepek fejlődnek: a (palato)quadratum porc az első zsigerív dorsalis, a mandibularis (Meckel– féle) porc pedig annak ventralis részén (1.ábra, 48–72h) A második zsigerívből differenciálódó dorsalis hyomandibularis porc ventralisan a szájfenék izomzatát támasztó ceratohyalis porchoz kapcsolódik. A porcok mellett az azokat mozgató izomzat is kialakul. A 3–6-dik zsigeríveken megjelennek a kopoltyúk, s közöttük kialakulnak a kopoltyúrések (az első a hyoid ív mögött, az utolsó a garatív előtt). A garatíven megjelennek a garatfogak. 7 Halfejlõdés Zebrahal http://zfin.org/zf info/zfbook/stages/indexhtml 1.ábra Az embrionális fejlődés egyes állomásai camera lucida

rajzokon Felfelé a korai stádiumokban az animalis pólus néz, később a feji vég (kivéve két ábrához – girmring, shield – tartozó animalis pólus felöli nézeteket). Az embrió többnyire bal oldalról láthat A pigmentáció nincs feltüntetve 1 cell 2 cells 4 cells 8 cells 16 cells 32 cells 64 cells 128 cells 256 cells 8 Halfejlõdés Zebrahal http://zfin.org/zf info/zfbook/stages/indexhtml 512 cells 1k cell high YSL oblong sphere dome I-YSL 30% epiboly 50% epiboly girmring csíraöv 9 Halfejlõdés shield 8h feji vég csíraöv Zebrahal http://zfin.org/zf info/zfbook/stages/indexhtml embriópajzs 9h epiblast Brachet-rés hypoblast feji vég szikdugó embriópajzs csíraöv 10h 11h 12h szemhólyag somiták farokbimbó 10 Halfejlõdés Zebrahal http://zfin.org/zf info/zfbook/stages/indexhtml 14h 16h 18h fülhólyag 19.5h 22h 25h mesencephalon cerebellum mesencephalon cerebellum 11 Halfejlõdés Zebrahal

http://zfin.org/zf info/zfbook/stages/indexhtml 31h 35h 42h mandibularis ív mandibularis ív hyoid ív hyoid ív kopoltyúívek szív 48h 60h 72h Meckel-porc szív (palato)quadratum porc szív úszóbimbó mell- kopoltyú- úszó ívek 12 Halfejlõdés http://zfin.org/zf info/zfbook/stages/indexhtml Zebrahal 2.ábra A segregatio első 5 osztódása az animalis pólus felöl nézve A külső, sejtek alatti, körgyűrű a sziksejt membránja, az “A” ábrán az osztatlan ellipszis a csírakorong. “B-F” az egymást követő osztódások, amelyek közül a páratlan számúak a csírakorong rövidebb, a párosak pedig a hosszabb tengelyével párhuzamosak. (Kimmel, 1991) (Az embrió feji vége balkéz felé esik) feji vég 3.ábra A DEL-sejtek sorstérképe 50%-os epibóliánál, a girm ring és a hypoblast megjelenése előtt Ekkor a blastoderma félgömbként borul a sziksejtre. Az EVL sejtek a peridermát alkotják, így itt nem szerepelnek,

csakúgy, mint ahogy nincs ábrázolva az YSL és a sziksejt sorsa sem. A rajz egyes szervtelepeket nem mutat (ilyen pl. a kikelési mirigy a garathám dorsalis szegélyén) A gyomor, hasnyálmirigy és az úszóhólyag a máj mellett, attól lateralisan, a simaizmok telepe pedig a szív szomszédságában helyezkedik el. 13 Halfejlõdés http://zfin.org/zf info/zfbook/stages/indexhtml Zebrahal 4.ábra Gastrulatio Felső kép: sejtvándorlások az embriópajzs területén és környékén (dorsalis nézet) Alső kép: a gastrula hosszmetszete. A blastoderma szegélyén (germ ring) sejtek fordulnak a mélybe csakúgy, mint az embriópajzs területén. Az előbbi területen bevándorló sejtek a paraaxiális, míg az utóbbinál bevándorlók az axialis mesodermát képezik majd. 14 Halfejlõdés http://zfin.org/zf info/zfbook/stages/indexhtml Zebrahal 5.ábra A secunder neurulatio kezdeti lépései keresztmetszeti képeken. (Papan and CamposOrtega, 1994) A: a velőlemez

hengerhámsejtjei, B: a sejtek besüllyedése, D: a tömör neuralis pálca. 6.ábra A központi idegrendszer tagolódása a szegmentációs periódusban. A: a 6-somitás állapotban nincs morfológiai tagolódás. B: A 18-somitás embrióban 10 neuromer jelenik meg (telencephalon(T), diencephalon (D), mesencephalon (M), valamint 7 rhombomera (r1–7)). C: A diencephalon dorsalis oldalonán az epiphysis (E) jelenik meg, a ventralis oldal kiszélesedésével pedig a hypothalamus indul fejlődésnek (D). A középagyban elkülöníthető a tectum (M) és a tegmentum. A cerebellum (C) világosan elválik a közép- és utóagytól. (Kimmel, 1993; scale bar: 200 µm) 15