Egészségügy | Tanulmányok, esszék » Dr. Lázár Áron - A csontritkulás és a műtéti csontpótlás molekuláris biológiai megközelítése

A csontritkulás és a műtéti csontpótlás molekuláris biológiai megközelítése Doktori értekezés Dr. Lazáry Áron Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Takács István, egyetemi docens, PhD Hivatalos bírálók: Dr. Szekanecz Zoltán, egyetemi tanár, az MTA doktora Dr. Lacza Zsombor, egyetemi tanársegéd, PhD Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Szendrői Miklós, egyetemi tanár, az MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr.Donáth Judit, adjunktus, PhD Dr. Szűcs Nikolett, egyetemi tanársegéd, PhD Budapest 2009 Tartalomjegyzék 1. Rövidítések jegyzéke 4 2. Bevezetés 5 2.1 Az oszteoporózis és szövődményeinek népegészségügyi 5 jelentősége 2.2 2.21 A csontanyagcsere molekuláris biológiája 8 A csontsejtek közötti molekuláris együttműködés a remodeling 9 során 2.22 A remodeling endokrín szabályozása 13 2.3 A csontritkulásban szerepet játszó génpolimorfizmusok 17 2.4

Új kandidáns gének azonosítása – a szarvas-modell 18 2.5 A kompressziós csigolyatörések minimál invazív sebészi 21 kezelésének lehetőségei 2.6 2.61 A sebészi csontpótlás aktuális kérdései 24 A gipsz szerepe a csontpótlásban 27 3. Célkitűzések 28 4. Módszerek 29 4.1 A vizsgálati alanyok szűrése és beválogatása 29 4.2 Gének és SNP-k kiválasztása 29 4.3 DNS izolálás és genotipizálás az SNPstream rendszerrel 32 4.4 Nucleus pulposus sejtek izolálása, tenyésztése és kezelése 33 4.5 MC3T3 sejtek tenyésztése különböző tenyésztő-felszíneken 33 4.6 Sejtszám-meghatározás 34 4.7 Alkalikus foszfatáz aktivitás és Ca2+-koncentráció 35 meghatározása 4.8 Génexpressziós vizsgálatok 35 4.9 Statisztikai analízis 36 4.91 Leíró statisztikai módszerek 36 4.92 Elemző statisztikai módszerek 37 4.93 Szekvencia analízis 38 2 5. Eredmények 40 5.1 Új génpolimorfizmusok

kapcsolata a csontritkulással 40 5.11 A vizsgálat egyes paramétereit leíró statisztikai analízisek 40 eredményei 5.12 Asszociációs vizsgálatok 40 5.13 Gén-gén interakciók elemzése 44 5.2 A szintetikus csontpótló graftok alkalmazásának 46 A szintetikus graftok hatása a nucleus pulposus (NP) sejtek 46 molekuláris biológiai aspektusai 5.21 életképességére 5.22 Génexpressziós változások a csontpótló anyagok hatására 48 izolált nucleus pulposus sejtekben 5.23 Az MC3T3 preoszteoblasztok alakja, osztódása és médium 49 alkalikus fosztfatáz aktivitása különböző tenyésztő felületeken 5.24 A gipsz felület és a magas Ca2+ koncentráció hatása a 51 preoszteoblasztok génexpressziós profiljára 6. 6.1 Megbeszélés Új kandidáns gének összefüggése a csontdenzitással és a 55 55 törési rizikóval 6.2 A kompressziós csigolyatörés minimál invazív kezelésében 58 alkalmazott csontcementek hatása a

nucleus pulposusra 6.3 A szintetikus csontpótló graftként felhasználható gipsz 61 hatása preoszteoblaszt sejtekre 7. Következtetések 64 8. Összefoglalás 69 9. Irodalomjegyzék 71 10. Saját publikációk jegyzéke 95 11. Köszönetnyilvánítás 97 3 1. Rövidítések jegyzéke AGC1 – aggrekán ALOX12 – arahidonsav-12 lipoxigenáz ALP /ALPL/ – alkalikus foszfatáz AND – androgén ANOVA – varianciaanalízis BGLAP – oszteokalcin gén BGN – biglikán BMD – csontsűrűség BMI – testtömeg index BMP – csont morfogenetikus fehérje BMU – többsejtes elemi egység BSP – csont szialoprotein CASR – kalcium-szenzor CATK – katenin COL1 – I. típusú kollagén C.I – konfidencia intervallum CT – kalcitonin D3 – D-vitamin DBM – demineralizált csontmátrix DCN – dekorin DEXA – kettős energiájú röntgen abszorpciometria E3 – ösztrogén ECM – extracelluláris mátrix ESR1 – ösztrogén receptor-1 FABP3 – zsírsav

kötő protein-3 FGF – fibroblaszt növekedési faktor FGFR1 – fibroblaszt növekedési faktor receptor-1 FN1 – fibronektin-1 GAPDH – glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz GH – növekedési hormon GLM – generalizált lineáris modell G x G – gén-gén interakció HA – hidroxi-apatit HSC – hemopoetikus őssejt IGF1 – inzulin-szerű növekedési faktor-1 IL – interleukin KCST – kompressziós csigolyatörés KORT – glükokortikoidok KP – kyphoplasztika LRP5 – lipoprotein receptor-kapcsolt fehérje-5 LRT – log-likelihood ratio teszt (valószínűséghányados próba) MAF – ritkább allél frekvenciája M-CSF – monocita-coloning stimuláló faktor MSC – mesenchymális őssejt MMP – mátrix metalloproteináz NFκB – nukleáris faktor kappa B NO – nitrogén-monoxid NP – nucleus pulposus OB – oszteoblaszt OC – oszteokalcin OCY – oszteocita OK – oszteoklaszt ON – oszteonektin OP – oszteoporózis OPG – oszteoprotegenin OPN –

oszteopontin O.R – esélyhányados PBS – foszfát pufferelt sóoldat PG – prosztaglandin PMMA – polimetil-metakrilát PPARγ – peroxiszóma proliferátor-aktivált receptor gamma PTH – parathormon RANK – nukleáris faktor kappa B receptor aktivátor RANKL – nukleáris faktor kappa B receptor aktivátor ligand SD – szórás SIBLING – kis integrin kötő N-glikolizált protein SNP – egypontos nukleotid polimorfizmus T3/4 – pajzsmirigy hormon TCP – trikalcium-foszfát TGFβ – transzformáló növekedési faktor béta TIMP2 –metalloproteináz szöveti inhibítor-2 TNFα – tumor nekrózis faktor alfa TP – tenyésztő plate TRAP – tartarát rezisztens savi foszfatáz TSH – pajzsmirigy stimuláló hormon VDR – D-vitamin receptor VP – vertebroplasztika 4 2. Bevezetés 2.1 Az oszteoporózis és szövődményeinek népegészségügyi jelentősége Az oszteoporózis (OP) a csont mennyiségi és minőségi jellemzőinek progresszív

hanyatlásával jellemezhető népbetegség, mely a megváltozott szöveti és biomechanikai jellemzők miatt kis traumára bekövetkező, ismétlődő törésekhez vezet, magas morbiditási és mortalitási következményekkel. Az idősödő, indusztriális társadalmakra jellemző kórképben szenvedők száma az utóbbi évtizedekben megtöbbszöröződött, a második évezred elején világszerte több mint 200 millió ember él csontritkulással, és a betegek száma a jövőben nőni fog [1-3]. Az USÁ-ban 10 millió felett van az OP-ban szenvedők aránya, és az oszteoporotikus törések száma meghaladja az évi 1,5 milliót, több mint 17,9 milliárd dollár egészségügyi kiadást okozva [4]. Hazánkban 900 ezer főre tehető a csontritkulásban szenvedők száma, a betegek 2/3-a nő, 1/3-a férfi [5]. A porotikus töréseket tekintve évi 30-40 ezer kompressziós csigolyatöréssel számolhatunk, amelyek nagy része felderítetlen, kezeletlen eset. A

csuklótörések száma 25 ezerre, a csípőtáji töréseké 15 ezerre tehető, és jelentős (évi 8-10 ezer) a csontritkulással összefüggő proximális humerus törések száma is [5, 6]. Az oszteoporózis és a csonttörések incidenciája drámaian megnő 50 éves kor felett; addig amíg 50 éves korban bármely törés elszenvedésére 2% az esély, ez 85 éves korra 28%ra nő [7]. Ennek oka egyrészt, hogy az idősödő szervezetben eleve könnyebben alakul ki az oszteoporózis, az életkorral járó biológiai, táplálkozási és életmódi változások miatt, másrészt a nőknél a menopauza hormonális következményei drasztikus hatással vannak a csontszövet biológiájára. A menopauzát követő öt-tíz évben bekövetkező csontvesztést írhatjuk a hormonális változások számlájára (posztmenopauzás OP), az idősebb életkorban kialakuló csontritkulás szorosabb összefüggést mutat a szeniumban bekövetkező élettani változásokkal (szenilis OP). Az

incidencia adatok is jelzik a nők fokozott rizikóját. Egy 50 éves nőnek 40% esélye van, hogy hátralévő életében oszteoporotikus törést szenvedjen el, míg férfiaknál ez a rizikó kevesebb, mint 15% [8]. A korábban elszenvedett törések drámaian emelik a következő oszteoporotikus törések kockázatát. Egy csigolya kompressziós összeroppanását követő egy éven belül, a betegek 20%-a újabb törést szenved el. Csuklótörést követően duplájára nő a kockázata a csípőtáji törés bekövetkezésének [7]. A törések növelik a mortalitást is; a csípőtáji törést követő egy éven belül a női betegek 17%-a halálozik el, a férfiaknál ez az arány 31% [9]. Kompressziós-csigolyatörés esetén a nők körében a halálozási kockázat több mint 60%-kal emelkedik és a fájdalommal járó törések esetében az egy éven belüli mortalitás 25-30% [10]. A halálozási mutatók alakításában jelentős szerepe van a törésekkel járó

komorbid állapotoknak. A csípőtáji törést bekövetkezte után fél évvel a betegek 90%-a képtelen 800 métert egyedül gyalogolni, vagy félemeletnyit lépcsőn felmenni. A járóképesség még öt éves betegségtörténet után is nagymértékben beszűkült, a betegek 60%-a használ valamilyen segédeszközt és csak a betegek 20%-a fájdalommentes [11]. A hosszú immobilis állapot következtében kialakuló kórállapotok mellett (pneumónia, mélyvénás trombózis stb.), számolni kell azzal is, hogy a betegeknél – mozgásképességük beszűkülése következtében – drámaian tovább romlik a csontrendszer állapota. Az első – gyakran még traumára bekövetkező – törés után, az újabb oszteoporotikus törés olyan kismértékű erőbehatásra is bekövetkezhet, mint az ülő helyzetből történő felállás, vagy az ágyban történő megfordulás. Az OP diagnosztikájában elengedhetetlen lépés a csont ásványi anyag tartalmának, a

csontsűrűségnek (bone mineral density, BMD) a mérése. A kettős energiájú röntgen abszorpciometriás technikával (DEXA) g/cm2-ben mérhető csontdenzitás jól jellemzi az adott régió csont-egészségét és a csökkent BMD fokozott törési rizikóval jár. A három standard mérési hely (combnyak, lumbális gerinc, disztális radius) BMD-jének 1 szórás-értéknyivel (SD) való csökkenése bármely oszteoporotikus törés elszenvedésének rizikóját 1,5-szeresére növeli. A combnyak esetében a BMD 1 SD-vel való csökkenése 2,6-szoros combnyak-törési rizikót von maga után [12]. A vizsgálat során oszteoporózisra utal a BMD-ből származtatott T-score alacsony értéke. A T-score az adott egyén csontdenzitásának eltérését jelzi a fiatal felnőttpopuláció csontdenzitás-átlagától, SD-ben megadva. Az európai gyakorlattól eltérően (ahol Tscore < -2,5 alatt tekintjük kezelendő mértékűnek a csontritkulást), az USÁ-ban a terápiás

ajánlások „szigorúbbak”. Ott a csonttörések megelőzése érdekében, egyéb rizikófaktor hiányában T-score < -2,0 a kezelés határa, és T-score < -1,5 az ajánlás abban az esetben, ha más rizikó faktor is jelen van [13]. Az OP kialakulására és az oszteoporotikus törésekre hajlamosító rizikó faktorokat az 1. táblázatban foglaltuk össze Számos független vagy egymást 6 befolyásoló tényező vezethet a fokozott törési rizikóval járó kórállapot kialakulásához. A „környezeti” rizikó faktorok közül több tényező befolyásolható (kalciumbevitel, alkoholfogyasztás, mozgáshiány stb.), míg számos tényező nem befolyásolható (életkor, nem stb.) 1. Táblázat ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ Az oszteoporotikus törések kockázatát növelő faktorok [12] Női nem Életkor Alacsony BMD Családban előforduló csípőtáji törés Szteroid-használat BMI < 20 kg/m2 Korábbi porotikus törés Dohányzás

Alkoholfogyasztás > 2 egység/nap Fokozott csont-turnover Korai menopauza ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ ƒ Primer vagy szekunder amenorrhoea Primer vagy szekunder hypogonadizmus Elégtelen Ca-bevitel D-vitamin-hiány Ázsiai vagy kaukázusi rassz Immobilizáció Csökkent fizikai aktivitás Neuromuszkuláris betegség Látáscsökkenés A BMD kialakításában az életmódi faktorok mellett örökletes, genetikai tényezők is szerepet játszanak. A genetikai faktorok jelentőségére irányították a figyelmet azok a kutatások, amelyek leírták a kóros csontsűrűség családon belüli halmozódását és a betegség prevalenciájának etnikai különbségeit. Régóta bizonyított, hogy a csúcscsonttömeg 60-80%-ban genetikailag determinált [9, 14-16], de a folyamatra ható gének pontos szerepét – csakúgy, mint a remodeling és a csontvesztés genetikai hátterét – az 1980-as évektől folyó intenzív kutatások ellenére – még nem ismerjük. Azon belül, hogy az

OP multifaktoriális eredetű betegség, a genetikai háttér kialakításában számos gén együttes hatása érvényesül, tehát a kórkép poligénes öröklődésű [17, 18]. Nem sikerült olyan gént találni, amelynek mutációja egyértelműen felelős a csontritkulás kialakulásáért, sőt napjainkig több mint 200 gént azonosítottak, amelyek szerepe a csontanyagcserében illetve az OP patogenezisében valószínűsíthető, és számos gén variánsairól bizonyították, hogy ha kis mértékben is, de szignifikánsan befolyásolják a BMD-t és/vagy a törési rizikót [19, 20]. A 20 század végi kutatások fókuszában az egyes gének, adott génvariánsok szerepének leírása szerepelt, azonban 7 ezek eredményei – részben metodikai okokra visszavezethetően – ellentmondásosak. A legmodernebb molekuláris biológiai eszközök és adatfeldolgozási módszerek lehetőséget teremtettek arra, hogy – egyszerre több gént/génvariánst vizsgálva

– a komplex, poligénes betegség molekuláris patogenezisének megértéséhez közelebb kerüljünk, és a nem túl távoli jövőben ezekre a genetikai, molekuláris biológiai kutatásokra alapozva új diagnosztikai eszközöket és hatékony terápiás módszereket fejlesszünk. 2.2 A csontanyagcsere molekuláris biológiája A csontszövet speciális felépítésű szövet, mivel a szerves alkotóelemek mellett szervetlen – döntően hidroxi-apatitból [Ca10(OH)2(PO4)6] álló – állományt is tartalmaz. A hidroxi-apatit (HA) kristályokban fizikai erőbehatásra piezoelektromos jelenség lép fel, amely a kristály egyes felületeinek oldhatósági változásához vezet és a kristályszerkezet átépülését eredményezi. A szöveti változásokat tehát leképezik az apatit kristályok, ezért lehet a HA a dinamikusan rigid vázrendszer optimális szervetlen alkotóeleme [21]. A fejlődő vázrendszer kezdetben kötőszövetes-porcos elemekből áll, majd a késői

embrionális korban kezdődik a mineralizáció folyamata, és a 2. dekádig folytatódik a csontok hosszirányú növekedése. A csontok életének ebben a szakaszában – növekedés és modeling – a csontképződés dominál, és az újcsontképzés nem igényel előzetes csontlebontást. Ez a folyamat a 2 dekádban a növekedési porcok elcsontosodásával véget ér, a csontok elérik végleges dimenzióikat. A mineralizáció még pár évig intenzíven folyik, ezért tehető a csúcscsonttömeg elérése a 2. dekád végére. A felnőttkori csontélettanra a remodeling folyamata jellemző, amely a felnőtt, érett csont folyamatos átépülését jelenti. A remodeling során a csontformáció és reszorpció térben és időben szorosan kapcsoltan zajlik és egészséges szervezetben a két folyamat intenzitása megegyezik [22]. A felnőtt szervezet tehát – ideális esetben – tartani tudja csúcscsonttömegét, miközben a folyamatos remodeling következtében a teljes

vázrendszer 10 évente megújul [8]. Míg a növekedés és a modeling jobban érinti a hosszú csöves csontokat, a remodeling folyamata a trabeculáris csontállományban (köbös és lapos csontok, csöves csontok epifízise) intenzívebben zajlik. A remodeling 8 soksejtű, elemi egységekben (BMU - basic multicell unit) zajlik a csontok perioszteális és endokortikális felszínén. A szerves és szervetlen állomány – időben és térben megfelelő mértékű – képzése több szinten szabályozott folyamat. A csontállomány termelése és bontása végeredményben a csontsejtek, az oszteoblasztok, az oszteoklasztok és az oszteociták jól összehangolt együttműködésének köszönhető. 2.21 A csontsejtek közötti molekuláris együttműködés a remodeling során A csontszövetben található sejtek közül kiemelt jelentősége van az oszteoblasztoknak (OB), mivel elsődlegesen csontképző sejtekként funkcionálnak és a remodeling elsődleges

szabályozásáért felelnek (1. Ábra) Az oszteoblasztok a csontvelő stromában elhelyezkedő mesenchymális őssejtekből (MSC) keletkeznek. Az MSC csontsejt irányú differenciálódásban fontos szerepe van a csont morfogenetikus proteineknek (BMP-k), a Runx és a SMAD transzkripciós faktor családoknak és kiemelt jelentőségű a Wnt szignál-útvonal [23-27]. Az MSC-ből más faktorok hatására differenciálódhat porcsejt (chondroblaszt), izomsejt (mioblaszt), fibroblaszt és adipocita is [26, 28]. A chondrogenezis fontos szignálja a SOX9, míg az MSC zsírsejt irányú differenciálódásában kiemelt szerepe van a PPARγ transzkripciós faktor expressziójának [29, 30]. Az érett oszteoblasztokra az extracelluláris (EC) mátrixot alkotó fehérjék intenzív termelése jellemző. A csontszövet szerves állományának 90%-át kollagén és nem kollagén típusú mátrix fehérjék alkotják. A csontra jellemző kollagén típus a glicinben és prolinban gazdag

I. típusú kollagén, melynek kétféle láncmolekulája (α1 és α2) két génről íródik át (COL1A1 és CO1A2). Az ún minor kollagének (III, V, X típusok) a COL1-rostok „összeszerelésében” és a kollagén-hálózat integritásában játszanak szerepet. A nem kollagén típusú mátrix elemek közé tartoznak a proteoglikán, a glikoprotein-, a gamma-karboxilált- és az ún SIBLING- (small integrin binding Nglikolizált protein) fehérjecsaládok tagjai Általánosságban az ide tartozó kis mátrixmolekulák a kollagénfibrillumok közti keresztkötések és a sejt-mátrix kapcsolat kialakításáért, fenntartásáért felelősek. A biglikán (BGN) a fejlődő-, növekedő-, a 9 dekorin (DCN) az érett csontra jellemző két fontos proteoglikán [31, 32]. Mindkét molekulának szerepe lehet a transzformáló növekedési faktor (TGFβ) transzkripciós faktor család tagjainak megkötésében, és így a csontsejtek proliferációjának és

differenciálódásának szabályozásában is [32-35]. A csontszövetben expresszálódó nem szövetspecifikus alkalikus foszfatáz (ALP) felelős a foszfátvegyületek hidrolítikus hasításáért, így a HA képződéséhez szükséges foszátionok szöveti koncentrációjának növeléséért. Az ALP – EC Ca2+-kötő fehérjeként – a mineralizáció folyamatát is precipitálja [22]. Az oszteonektin (ON) az oszteoblasztok érésében, proliferációjában és a mineralizációban játszik szerepet [36, 37]. A SIBLING fehérjecsaládba tartozik – egyebek mellett – a csontszövetre specifikus csont szialoprotein (BSP), az oszteopontin (OPN) és a fibronektin-1 (FN1), amelyek a Ca2+-ionok kötéséért és az egyes mátrixelemek összekapcsolásáért illetve a – remodeling folyamatában obligát – sejtmátrix kapcsolatok fenntartásáért felelősek [38-40]. Az oszteokalcin (OC) olyan gamma-karboxilált fehérje amely csak a csontszövetben termelődik és a csont

bontás szabályozásában van szerepe. Ca2+-kötő tulajdonsága – a protein-S-hez hasonlóan – Kvitamin dependens poszttranszlációs módosulásoktól függ [41, 42] Az oszteoblasztok – az intenzív termelés következtében – körbe veszik magukat az oszteoid állománnyal, és a csontfelszínről a mélyebb rétegekbe kerülve oszteocitává (OCY) alakulnak. A korábbi elképzelésekkel ellentétben ma már tudjuk, hogy az oszteociták nem passzív, nyugvó sejtek, hanem aktívan részt vesznek a szöveti metabolizmusban és a remodelingben is. Ezek a sejtek mechanoreceptorként működnek, a csontot ért erőbehatások, mechanikai ingerek molekuláris változásokat indukálnak az oszteocitákban [43-45]. Mivel az oszteociták nyúlványaik segítségével kapcsolatban állnak egymással, ezért valószínűsíthető, hogy a fizikai ingerek következtében kialakuló biológiai változások egész sejt-hálózatokat érintenek, így a csontszövet nagyobb kiterjedésű

területén indukálódik a remodeling folyamata [46]. Az oszteociták az EC mátrix metabolizmusában is szerepet játszanak, oszteokalcin és más mátrix-elemek termelésével. A mechanikai ingerre a sejtek inzulin-szerű növekedési faktor-1 (IGF1), nitrogén-monoxid (NO), RUNX2 és prosztglandin (PG) szintézissel válaszolnak [47, 48]. Az előbbi három faktor elsődlegesen az oszteoblaszt érést illetve az oszteoblasztok mátrixtermelését serkenti, míg a PG a csontbontó oszteoklasztokra hat [45]. 10 TNFα adipocyta PPARγ IL4 SOX9 HSC MSC chondroblast IL6 M-CSF RANKL/RANK C-FOS NFkB IL1 BMP2,4 SMAD3 Wnt IGF1 IL11 RANK FGF RANKL PDGF OK OPG OB H+ CATK TRAP BMP DCN BSP COL1A1 FN OPN BGN ON AGC ALP MMP TGFB OC HA OCY RUNX2 IGF1 NO PG mechanikai inger serkentés gátlás differenciálódás 1. Ábra A remodeling folyamatában szerepet játszó molekuláris rendszer Az oszteoklasztok (OK) a hemopoetikus őssejtből (HSC) keletkeznek és a

monocitákkal mutatnak rokonságot [49]. A több sejt fúziójából létrejövő, sokmagvú óriássejtek érésében a monocita-coloning stimuláló faktornak (M-CSF), a c-FOS-nak, az NFkB-nak és a RANKL-RANK rendszernek tulajdonítanak jelentőséget [50-52]. Az érett oszteoklasztok nem-specifikus észterázok (pl. tartarát rezisztens savi foszfatáz TRAP), kollagenázok, mátrix metalloproteinázok (MMP), kateninek (CATK) termelésével a szerves alkotóelemek lebontását végzik [43, 53]. A csont felőli hullámos sejtfelszín bővelkedik protonpumpákban és transzmebrán klorid-csatornákban; a HA lebomlásához szükséges savas kémhatású környezetet is ezek a sejtek tartják fent. A remodeling során az oszteoklasztok kis mélyedéseket vájnak ki maguk alatt a csontban, majd elhagyják az üreget, ahová aztán oszteoblasztok kúsznak be és elkezdik termelni az új csontállományt. 11 A remodeling fontos eleme az oszteoblaszt-oszteoklaszt kapcsolat, amely a

folyamat fő parakrín szabályozási csomópontja [54-56]. Az aktív oszteoblasztok számos olyan molekulát expresszálnak, amelyek a csontsejtek érését, működését közvetlenül befolyásolják. Elsősorban autokrín módon ható faktorok az IGF1 és a fibroblaszt növekedési faktor (FGF), amelyeket az oszteoblasztok termelnek és saját érésüket, működésüket serkentik velük. Az oszteoid állományba az oszteoblasztok BMP-ket és TGFβ-t építenek. Az oszteoklasztok működésének következtében, az oszteoid állomány degradálódásával ezek a faktorok felszabadulnak a mátrixból és a csontbontó oszteoklasztokra illetve a csontbontó enzimekre közvetlenül gátló hatást fejtenek ki, míg a csontépítő oszteoblasztok érését és mátrix-termelését serkentik [55]. Ez a folyamat gyakorlatilag egy időben – akár hónapokra, évekre – elnyújtott parakrín szabályozási elem. Az oszteoblasztok számos olyan faktort/citokint termelnek, amelyekkel a

gyulladásos reakció kapcsán, az immunrendszer működésének leírása során találkozhatunk. A csontmetabolizmus és az immunrendszer kapcsolatának feltérképezése az oszteoimmunológia tárgykörébe tartozik, de számos kísérleti oszteoporózis gyógyszer a fenti kapcsolatok molekuláris hálózatának modulálásán keresztül hat [57, 58]. Az oszteoklasztok felszínén expresszálódik az NF-κB receptor aktivátor molekula (RANK), melynek ligandja, a RANKL az eddig megismert legerősebb oszteoklaszt aktiváló faktor [59-61]. A RANKL-t az oszteoblasztok termelik és a RANK-RANKL kapcsolódás hatására több oszteoklaszt keletkezik és az érett oszteoklasztok intenzív csontbontásba kezdenek. Az oszteoblaszt azonban termel egy oszteoprotegeninnek (OPG) nevezett fehérjét, amely szolubilis RANKL receptorként a RANKL-hoz kötődve megakadályozza a RANKL-RANK kapcsolódást (decoy receptor) és így az oszteoklaszt aktivációt [62, 63]. A fenti folyamat

következménye, hogy a remodeling során kiemelt jelentősége van a szöveti RANKL/OPG hányadosnak. Amennyiben az OPG expresszió csökken, vagy a RANKL expresszió megnő (és itt a ligand és a receptor funkcionális változásait is ide kell érteni) a csontbontás fokozódik, a remodelinget szimbolizáló mérleg nyelve a reszorpció irányába billen. Ellentétes hatású a blasztok OPG termelésének megnövekedése, vagy a klasztok RANK expressziójának csökkenése [64-66]. 12 A RANK/RANKL/OPG rendszer mellett, számos egyéb citokin vesz részt a remodeling szabályozásában [57, 58, 67]. Az oszteoblasztok által termelt interleukin-1 (IL1) kettős hatású molekula [68]. Egyfelől serkenti az oszteoblasztok kollagéntermelését, másfelől részben közvetlenül, részben a reszorpciót fokozó interleukin-6 (IL6) expressziójának és hatásának erősítésével az oszteoklasztokat aktiválja [69]. Az IL6 nagyon erős reszorpciós hatású molekula, és

ezt jól példázza, hogy IL6 illetve IL1 hiányos egerekben még ovariektómia hatására sem fejlődik ki oszteoporózis [70-72]. Az interleukin-11 (IL11) szintén a blasztok által termelt citokin, amely a klasztok működését serkenti [73]. A T-limfociták által termelt citokinek az oszteoblasztokra gátló, míg az oszteoklasztokra serkentő hatású interleukin-4 (IL4) és a mindkét sejtre serkentő hatású, tehát a teljes remodeling folyamatát fokozó tumor nekrózis faktor alpha (TNFα) [74]. Az előbbiek szerepe kiemelt a különböző autimmun kórképekhez (pl. rheumatoid arthritis) kapcsolódó fokozott periartikuláris csontritkulásban [75], de a primer oszteoporózisban és a fizilógiás remodelingben is jelentős funkcióval bíró molekuláris tényezők [76]. 2.22 A remodeling endokrín szabályozása A csontanyagcsere szabályozásában számos endokrín faktor vesz részt. A három direkt kalcitrop hormon – parathormon (PTH), D-vitamin (D3),

kalcitonin (CT) – mellett számos hormon és citokin a véráram útján jut a csontsejtekhez, amelyekre közvetlen vagy közvetett hatást gyakorolva befolyásolják a remodeling folyamatát (2. Ábra). Az endokrín szabályozás kapcsán is kiemelendő a fent részletezett – csontsejtek közti – molekuláris kommunikációs hálózat, mivel számos hormon hatása ennek a hálózatnak a befolyásolása útján valósul meg [54]. A PTH-t a mellékpajzsmirigy fősejtjei termelik, a peptidhormon elválasztását stimuláló inger a szérum kalcium szint csökkenése. A PTH közvetlenül fokozza a vesében a Ca2+-reabszorpciót, és a D3-hatás fokozásán keresztül növeli a bélben a Ca2+felszívódást. A csontban PTH-receptort csak az oszteoblasztok felszínén találunk, a PTH direkt csonthatásai az oszteoblasztok közvetítésével valósulnak meg. A PTH a csontbontás fő fiziológiás aktivátora. Hatására az oszteoblasztok citokin-termelése megváltozik, az

oszteoklasztokat aktiváló IL1, IL6, IL11, és RANKL termelés 13 növekszik, míg az OPG-szint csökken, így az oszteoklasztok érése és aktivitása megnő, a csontból intenzív Ca2+-mobilizálás kezdődik. A PTH hatására az oszteociták csontbontó sejtekké alakulhatnak (oszteocitás oszteolízis). Ezek tükrében érthető, hogy a látens, vagy manifeszt hiperparatireózis miért jár súlyos csontrendszeri következményekkel. A PTH kapcsán meg kell említeni, hogy 1932-ben Selye János leírta a klasszikus csontreszorpciós PTH-hatás mellett, az intermittáló PTH-kezelés csonttömeg növelő következményét. Ma már bizonyított, hogy az intermittáló PTHkezelés hatására az OPG termelés fokozódik, miközben a RANKL-szintézis csökken az oszteoblasztokban, és a csökkenő RANKL/OPG arány a csontépítés irányába dönti a remodeling mérlegét. A fenti hatást kihasználva alkalmazhatunk – főleg súlyos esetekben – subcután teriparatid

(rekomibnáns PTH) injekciót oszteoporózis kezelésére jó eredménnyel. [21, 77-79] intesztinális Ca2+ abszorpció renális Ca2+ reabszorpció D3 PTH E3 CT T3/4 AND KORT GH OC prekurzor TNFα IL1 IL6 CTR IL11 RANKL IGF1 OPG ERα,β TGFβ VDR PTHR ERα,β osteocytás osteolízis ERα,β serkentő hatás gátló hatás közvetett hatások 2. Ábra Humorális faktorok a remodeling szabályozásában 14 A D-vitamin (D3) – vagy helyesebben D-hormon – az utóbbi években az egyik legtöbbet vizsgált hormonná vált. A D3-ra irányuló fokozott figyelem annak köszönhető, hogy a régen ismert klasszikus hatások (fokozott intesztinális Ca2+felszívódás, intenzívebb csont-remodeling) mellett az utóbbi évtizedben számos új szkeletális, illetve extraszkeletális D3-hatást írtak le (ún. nem-klasszikus D3-hatások) Felsorolás jelleggel említve, a D3 pozitív hatását erősítették meg autoimmun, fertőzéses és különböző tumoros

megbetegedések kapcsán, de a csontritkulás szövődményei szempontjából fontos tény, hogy D3 hiányában az izomzat állapota és az egyensúlyérzék is romlik, fokozva ezzel az elesések és így a törések előfordulási gyakoriságát. A D3 a sejtmagi receptorokon (VDR) keresztül fejti ki hatásainak javarészét, a receptor aktivációja gének transzkripcióját módosítja. A VDR az oszteoblasztokban és az oszteoklaszt-prekurzorokban is megtalálható, a D3 jelenléte szükséges a csontsejtek megfelelő éréséhez és működéséhez. Hatására nő az oszteoblasztok IL11, IL1, IL6 és RANKL-termelése, amelyek a klasztok működését serkentik, de a D3 ugyanakkor fokozza az IGF1 hatását és a blasztok TGFβ-termelését, így a mátrix-termelést és mineralizációt is. A D3 tehát a remodeling teljes folyamatát serkenti, elengedhetetlen hormon a csontállomány folyamatos megújulásához. A D3 pótlása szükséges minden olyan esetben, ahol a D3-hiány –

az elégtelen bevitel (táplálkozási okok), csökkent endogén képződés (napfény hiánya, időskor) vagy a fokozott szükséglet (pl. terhesség) – miatt bizonyított vagy feltételezhető. Az antiporotikus terápiának majd minden esetben része kell, hogy legyen a D3 szubsztitúció. [77, 80, 81] A kalcitonin (CT) a csontbontás legerősebb inhibitora [82]. Az oszteoklasztok felszínén található receptoraik aktivációja hatására a klasztok „megbénulnak”, összegömbölyödnek és abbahagyják reszorpciós tevékenységüket. A pajzsmirigy parafollikuláris C-sejtjeit aktiváló inger a szérum Ca2+-szint emelkedése. Humán OP terápiára elsősorban injekciós vagy orrspray formában bejutattot lazac-kalcitonin használható, és alkalmazásával az oszteoporotikus törésekkel összefüggő fájdalmak is csökkenthetők [83]. A női és a férfi nemi hormonok egyaránt hatással vannak a remodeling folyamatára [84]. Az ösztrogének (E3) receptorai

megtalálhatók minden csontsejten és gátolják a csontbontást részben a CT aktivitásának serkentésével, részben a PTH aktivitásának gátlásával. Ezenkívül az IGF1 expressziót növelve a blasztok kollagén és 15 TGFβ-termelését növelik, míg számos reszorptív citokin (TNFα, IL1, IL6) szintjét csökkentik [85]. Az ösztrogének csontvédő hatását jól szemlélteti a menopauza idején bekövetkező fokozott csontvesztés, amiért a menopauza időszakában bekövetkező drasztikus ösztrogén szint csökkenés felelős [86]. Az androgének (AND) kiemelt szerepe a növekedő csontban az epifízis fúgák „lezárása”, így a csont hosszirányú növekedésének leállítása és a mineralizáció serkentése. Felnőttben az androgének gátolják a csontbontást és növelik a csontképzést és ezt a hatásukat részben közvetetten érvényesítik, mivel az androgén hormonokból a szöveti aromatáz enzimek hatására ösztrogének keletkeznek [87].

A növekedési hormon (GH) és a pajzsmirigy hormon (T3/4) elengedhetetlen a csontok normális éréshez, a növekedés folyamatához. A GH szöveti mediátorain (csontban főleg az IGF1) keresztül fejti ki anabolikus hatását [88]. A pajzsmirigy hormonok (T3/4) csontrendszeri jelentőségét jól tükrözi a csökkent pajzsmirigy-hormon képzéssel járó csecsemőkori jódhiány illetve a veleszületett enzimzavarok következményei. Az ilyen betegek csontrendszere fejletlen, a növekedésben elmaradnak, csontjaik görbék, gyakrabban törnek. A T3/4 növeli az IGF1 termelést, így az oszteoblasztok aktivitását, másrészt – az IL6 és a TNFα expressziójának serkentésével – növeli az oszteoklasztok számát és aktivitását, így a remodeling teljes folyamatára hat [89]. A glükokortikoidok (KORT) csontrendszeri hatásaival szintén gyakran találkozhatunk betegség képében, a tartós szteroid kezelést követően kialakuló szekunder oszteoporózis

formájában [90]. Csökkentik a bélből a Ca2+-felszívódást, részben közvetlenül, részben a D3 aktiváció gátlásával és fokozzák a vesén keresztüli kalcium-vesztést. Az oszteoblasztok érésére és aktivitására negatív hatással vannak, így gátolva a csontépítést, míg az RANKL/OPG arányt kedvezőtlenül befolyásolva a reszorpciót serkentik [91]. Összefoglalva tehát a glükokortikoidok hatására csontvesztés következik be. A fenti – hangsúlyozottan rövid és a legfontosabb molekuláris tényezőkre fókuszáló – összefoglalásból látható, hogy a csontok élettanában, egészséges működésükben számos molekuláris tényezőnek (hormonok, enzimek, jelmolekulák és receptoraik valamint mindezek génjei stb.) kiemelkedő szerepe van Azt sem állíthatjuk, hogy egy faktornak vagy faktorcsoportnak kulcsszerepe van a remodeling 16 folyamatában, mivel maga a folyamat is többszinten értelmezhető. Sokkal inkább jól összehangolt

molekuláris hálózatok, egymással interakcióban, kapcsolatban lévő molekulák, gének együttes működése határozza meg a folyamat végső kimenetelét, amely a lokális (és generális) csontépítés / csontbontás arányaként definiálható. 2.3 A csontritkulásban szerepet játszó génpolimorfizmusok A kalcium metabolizmus és a csontsejtek szabályozásában részt vevő gének tanulmányozása során több mint kétszáz olyan gént azonosítottak már, amelyeknek az oszteoporózis kialakulásában szerepe van [19, 20, 92]. A betegség genetikai hátterében fontos tényezők a kandidáns gének allelikus variánsai és kiemelten az egypontos nukleotid polimorfizmusok (single nucleotide polymorphism, SNP). Számos ilyen genetikai variáns összefüggését írták le a csontdenzitással és/vagy a törési rizikóval, illetve más csontritkulásban vizsgált fenotípussal. Az SNP-k esetében az asszociációs vizsgálatok egy része ún. funkcionális SNP-ket

tanulmányozott, azaz, olyan polimorfizmust, ahol a báziscsere – feltételezhetően vagy bizonyítottan – a gén funkciójának (transzkripció, splicing stb.) megváltozását eredményezi és a kódolt mRNS / fehérje mennyiségében vagy minőségében kerül végül a genetikai hatás kifejeződésre. A vizsgálatok másik típusánál az SNP-k segítségével feltérképezték az adott gént, vagy egyes kromoszóma-szakaszokat, a betegséggel asszociált variánsokat genetikai markerként felhasználva. A kapcsoltsági viszonyok alapján a szignifikáns SNP-k kijelölik azokat a génszakaszokat, amelyeken beül – valószínűleg – található az alteráló gén-funkcióhoz vezető variáns. A kandidáns gének és SNP-k egy részénél az eredményeket a további vizsgálatok megerősítették, míg más SNP-k esetében a hasonló vizsgálatok eltérő vagy egymásnak ellentmondó következtetésre jutottak. Néhány kandidáns gén esetében a csontritkulásra gyakorolt

hatás bizonyítottnak tekinthető, a témában született nagyszámú asszociációs vizsgálat és az adott polimorfizmusok hatásának in vitro tesztelése során kapott eredmények alapján. Ezeket a kandidáns géneket a 2. Táblázatban foglaltuk össze 17 2. Táblázat Kandidáns gének az oszteoporózis patomechanizmusában Gén szimbóluma Kódolt fehérje neve Sejtélettani szerep Csontélettani szerepe Kapcsolat a csontritkulással liporpotein receptorkapcsolt fehérje 5 A kanonikus Wnt szignálútvonal koreceptorai, aktivációja eredményeként a b-katenin IC szintje emelkedik és a b-katenin regulált gének transzkripciója megnő. Serkenti az oszteoblaszt proliferációt, érést és működést. 1330Val és a 667Met allélok csökkent BMD-vel járnak és növelik a törési rizikót [92-98] COL1A1 I. típusú kollagén Major kollagénként a szövetek EC mátrixának felépítésében vesz részt. A csont EC mátrix fő szerves alkotóeleme. Az Sp1

„s” allélja szignifikánsan növeli a vertebrális törési rizikót és csökkent csontdenzitást eredményez. [99-102] TGFβ transzformáló növekedési faktor béta Kritikus intracelluláris folyamatok szabályozása az embrionális fejlődés és a posztnatális élet során. Az oszteoblasztok és az oszteoklasztok érésének és működésének szabályozása. Számos polimorfizmusát írták le az oszteoporózissal összefüggésben. [99, 103, 104] BMPs csont morfogenetikus proteinek Csontfejlődést serkentő molekulák. Az oszteoblasztok érését és működését serkentik. A BMP2 Ser37Ala polimorfizmusa és a BMP4 Ala152Val variánsa szignifikánsan befolyásolják a csontdenzitást.[92, 105-108] VDR D-vitamin receptor A D3 intracelluláris receptoraként gének transzkripcióját szabályozza. Az egészséges csontturnovert serkenti, az oszteoblasztok és az oszteoklasztok működésének szabályozásával. Régóta vizsgált polimorfzmusai (BsmI,

ApaI, TaqI) különböző mértékben befolyásolják a csontdenzitást és a törési rizikót. [107, 108] TNFS11 / TNFRSF11B NF-κB receptor aktivátor ligand (RANKL) / osteoprotegenin (OPG) Az OPG a RANKL szolubilis receptoraként gátolja a citokin kapcsolódását a sejtfelszíni receptorához (RANK). A RANKL az oszteoklasztok aktiválásán keresztül csontreszorpciót indukál. A RANKL promóterhaplotípusát illetve az OPG polimorfizmusait írták le a csontdenzitással összefüggésben. [18, 70, 92, 109-111] Az ösztrogén intracelluláris receptora. Aktivációja csontvédő hatású az oszteoblasztok serkentése és a reszorpciós citokinek termelésének gátlása révén. XbaI, PvuII SNP-ek és a promóter régióban található TA repeat polimorfizmusnak szerepét írták le számos vizsgálatban. [18, 99, 112, 113] LRP5 ESR1 2.4 ösztrogén recetor alpha Új kandidáns gének azonosítása – a szarvas-modell Az oszteoporózis humán betegség, nem fordul

elő más gerinces fajokban. Azonban a csontritkulás, mint jelenség megfigyelhető a különböző agancsos állatoknál, az agancsnövesztés ciklusos folyamatában. A gímszarvas (Cervus elaphus) képes az állatvilágban a legrobosztusabb csontépítő tevékenységre az éves ciklusokban zajló agancsképzés során [114, 115]. Az agancs növekedésének üteme meghaladhatja a 18 100g/napot is a május-júliusi időszakban, nem ritkán hatalmas, 14-17 kg-os kifejlett agancsot eredményezve. Az agancs növekedése egy módosult enchondrális csontképzési folyamat [116]. Ezt az intenzív csontépítést az állat 100-120 nap alatt végzi. Ilyenkor a szarvas kalciumban gazdag táplálékot fogyaszt, azonban a masszív ásványi anyag szükségletet nem tudja mind külső forrásból fedezni. Az agancsképzéshez szükséges ásványi anyagot saját csontvázából vonja ki, melynek következtében az állatban időszakos, fiziológiás oszteoporózis alakul ki [117].

A legjelentősebb csontreszorpció a bordákban tapasztalható, ahol a csont ásványi állományának 20-25%-a „eltűnik” az agancsképzés során. Az ún dőreség júliustól augusztus végéig eső időszakában – az agancs kifejlődése után – történik a csontvázba az „elvesztett” kalcium-tartalom visszapótlása. Ilyenkor az állat kalciumgazdag táplálékokat fogyaszt és pihen, elfekszik, kerüli a fizikai igénybevételt. Az agancs – már nem csontos – érésének befejeztével a csont-visszapótlás folyamata is teljessé válik, a hím szarvas szép, új agancsával és megújult, egészséges csontrendszerével készen áll a csatározásokkal járó őszi párzási időszakra (3. Ábra) A fenti folyamat – az ásványianyag-tartalom porotikus csontokba való visszapótlása – egyedülálló az élővilágban, pontos mechanizmusát nem ismerjük. Munkacsoportunk kollaborációja a gödöllői Mezőgazdasági Biotechnológiai

Kutatóközpontjának Genetika Intézetével, illetve az ELTE Genetikai Tanszékével azt a célt tűzte ki, hogy a szarvas agancsfejlődési ciklusa genetikai hátterének feltérképezése után olyan humán génortológokat azonosítunk, amelyek szerepe a csontritkulásvisszapótlás folyamatában kiemelten fontos lehet, és a humán oszteoporózis molekuláris hátterének megértéséhez és biológiai terápiák fejlesztéséhez közelebb vihetnek. A kutatás rendkívül szerteágazó folyamata során a gödöllői munkacsoport – expressziós array-ek segítségével – „meggyanúsított” olyan géneket, amelyek humán ortológját in silico azonosították [117]. Ezután munkacsoportunk egészséges és oszteoporotikus humán csontszövetben mérte a már korábban leírt kandidánsok, és az új gyanúsított gének – összesen 120 gén – expressziós szintjét, real-time PCR technikával [118, 119]. Az első vizsgálatok eredményeként megneveztünk öt olyan

gént, amelyek csontbiológiai szerepét már leírták vagy valószínűsítették, de a humán oszteoporózisban ezeket a géneket eddig nem vizsgálták, és saját vizsgálatainkban szignifikáns vagy trendszerű expressziós különbségeket mértünk az egészséges és a porotikus 19 csontszövetet összehasonlítva. Ezek a gének a következők voltak; alkalikus foszfatáz (ALPL), zsírsav kötő protein-3 (FABP3), fibroblaszt növekedési faktor receptor-1 (FGFR1), mátrix metalloproteináz-2 (MMP2), metalloproteináz szöveti inhibítor-2 (TIMP2). A további – a disszertáció szorosabb tárgykörébe tartozó – vizsgálatokban ezen új kandidáns gének allelikus variánsainak és a csontritkulásnak kapcsolatát vizsgáltuk. 3. Ábra A gímszarvas agancs-képző ciklusa A kora tavaszi időszakban kezdődik az új agancs növesztése, amely a vázrendszer oszteoporozisának fokozatos kialakulásával jár együtt (A). A késő nyári hónapok során kalciumdús

táplálék fogyasztásával a szarvas megkezdi a a csontrendszer visszapótlását (B), hogy az őszi párzási időszakra mind az agancs, mind a fizikai erőnlét szempontjából felkészült legyen (C). 20 2.5 A kompressziós csigolyatörések minimál invazív sebészi kezelésének lehetőségei Világszerte több mint évi 1 millió kompressziós csigolyatörés (KCST) következik be, főleg oszteoporotikus betegekben, és a KCST-ek száma évről évre növekvő tendenciát mutat [1-3, 120]. A csigolyakompressziót elszenvedők kilátásai, mind a morbiditást, mind a mortalitást tekintve romlanak. Az összeroppant csigolyatest csontcementtel való kitöltése egy olyan minimál invazív sebészi technika, amely segítségével jelentős mértékű fájdalomcsillapítás és kyphosis-korrekció érhető el az adott szegmentum belső stabilizálásával. A vertebroplasztika (VP) technikáját Galibert és munkatársai publikálták 1987-ben [121]. E technika során egy

apró bőrmetszést követően, az intrapediculárisan az összeroppant csigolyatestbe vezetett trokáron keresztül, csontcementet injektálunk a csigolyatestbe (4. Ábra) 4. Ábra A vertebroplasztika folyamata Az összeroppant csigolyatestbe a pediculusokon keresztül vezetjük a trokárt (A), amelyen keresztül beinjektáljuk csontcementet (B). A másik augmentációs technika, a kyphoplasztika (KP) – ahol a csontcementet egy felfújható ballonnal preformált üregbe töltjük – 1998-ben került először bemutatásra [122] (5. Ábra) A kyphosis korrekciót az első esetben a beavatkozást megelőző 21 a pozícionálással / fektetéssel, míg a második esetben a ballon felfújásával, a zömült csigolya volumenének „méretre duzzasztásával” érjük el (a beavatkozás során a beroppant véglemezek is kiegyengethetők, amely tovább csökkenti a fájdalmat és a degeneratív patológiák kialakulásának rizikóját). Mindkét technika

elterjedőben van a gerincsebészeti gyakorlatban, és az utóbbi időszakban jelentek meg olyan közlemények, amelyek szisztematikusan elemzik a beavatkozások rövid és hosszú távú hatásait, azonban a két technikát összehasonlító, kettős-vak randomizált prospektív vizsgálat még nem jelent meg a témakörben. 5. Ábra A kyphoplasztika technikája A beroppant csigolyatestbe először a ballont vezetjük, melynek felfújásával megemeljük a csigolyát és üreget formázunk. A csontcement ebbe az üregbe kerül az utolsó lépésben A csigolya-augmentációs technikák terápiás előnyeként az azonnali és szignifikáns fájdalom-csökkenést emelhetjük ki elsőként. Ez mindkét eljárás alkalmazásával elérhető és a sikeres beavatkozások esetében tartósnak bizonyult, sőt sokszor jobb eredményt kapunk a friss, adott esetben mozgáskorlátozottságot is okozó, nagyfokú fájdalommal járó KCST-k esetében [122, 123]. A kyphosis-korrekciót nem minden

esetben érhetünk el, de a KP technikájának előnye a VP-vel szemben, hogy a – szigorúbb indikációk betartása mellett – a csigolyatest beroppanását a ballon felfújásával közvetlenül korrigálhatjuk [123]. Mint minden beavatkozás, a minimál invazív augmentációs technikák is járhatnak szövődményekkel. A leggyakoribb komplikáció a csontcement-csorgás, amely a repedezett csigolyatestből történik és a posztoperatív röntgen képeken jól detektálható 22 [123, 124]. Ritkán fordul elő, de súlyos-életveszélyes következményekkel jár a vénás elvezetésbe történő cement-csorgás. A vénákba kerülő cement akár pulmonális embóliához is vezethet [125]. A foraminális vagy epidurális terekbe kerülő csontcement neurológiai tüneteket okoz és sürgős reoperáció indikációját képezi [126, 127]. Gyakrabban kerül csontcement a környező lágyrészek, izmok felszínére, és a leggyakoribb, mégis kevéssé vizsgált típusa a

csontcement-csorgásnak az, amikor az intervertebrális résbe, nevezetesen a porckorong nucleus pulposusába kerül a csigolyaaugmentációra szánt csontcement (6. Ábra) A közlemények a vertebroplasztikák esetében 5-25%-ra teszik az intradiscális cement-csorgás előfordulását – és ezek a makroszkópos, tehát röntgennel detektált esetek [128, 129]. A szövődmény biológiai és klinikai következményei nem ismertek. 6. Ábra Cement-csorgás a csigolyaközti porckorong állományába A műtét során az L4, L1 és Th12 csigolytestek vertebroplasztikájára került sor. A posztoperatív röntgenképen jól látszik az L1-2 és L3-4 közti résekben elhelyezkedő porckorongok nucleus pulposusába került radiodenz csontcement (piros nyilak). A klinikai gyakorlatban a csigolya-augmentációra polimetil-metakrilát (PMMA) típusú csontcementet alkalmaznak. Kísérletesen – állat és kadaver vizsgálatokban – kalcium-foszfát (HA) és kalcium-szulfát (gipsz)

alapú szintetikus csontpótló graftokat is sikerrel alkalmaztak a csigolya-plasztikás eljárások során [130-132]. Togawa és 23 munkatársai közölték, hogy az augmentált PMMA körül a csigolyatestben nekrotikus sejtek, idegen-test típusú gyulladásra jellemző óriássejtek és makrofágok találhatók [133], és számos korábbi vizsgálatban bizonyították a PMMA csontsejtekre gyakorolt káros termikus és biológiai hatását [134-137]. A vizsgálatok egyik következtetése az volt, hogy cementezett totál endoprotézisek beültetése után tapasztalt periprotetikus oszteolízis és csontreszorpció részben vagy egészben a PMMA cement káros biológiai hatásainak következménye lehet. A PMMA-val szemben a HA és a gipsz felszívódó, bioaktív anyagok, oszteokonduktív és oszteoinduktív tulajdonsággal [138, 139], és ez alapján alkalmasak lehetnek a biológiailag optimális csigolyatest-augmentáció kivitelezésére. Azt korábban nem vizsgálták, hogy a

különböző vertebroplasztikás szintetikus anyagoknak milyen biológiai-élettani hatása lehet a porckorongra. 2.6 A sebészi csontpótlás aktuális kérdései A csont a második leggyakrabban transzplantált szövet a vér után. Évi 2,2 millió csontpótlást igénylő beavatkozás történik világszerte [140, 141], ezért ideális csontpótló technikára, optimális beültetendő graftra nagy szükség van a modern egészségügyi ellátásban. A ma is arany-standardnak számító autológ csont graft felhasználásán kívül, az utóbbi évtizedekben számos egyéb csontpótló eljárás, graft-típus vált széles körben hozzáférhetővé (3. Táblázat) Az autológ csont beültetése elterjedten alkalmazott eljárás, melynek előnye a tökéletes biológiai megfelelőség (bár az oszteogén tulajdonság gyakran „sérül” az autológ csont megőrlésével járó előkészítési procedúra alatt) [142]. Az autograft alkalmazásának hátránya, hogy helyileg

limitált mennyiség nyerhető, a mennyiség növelésének céljából elvégzett párhuzamos „csontnyerő” operáció pedig fokozott műtéti megterhelést és a szövődmények kockázatának növekedését eredményezi [143]. A fenti problémákat [144] allograft beültetésével hidalhatjuk át. A csontbankból illetve kadaverből nyerhető – számos alakban, formában elérhető [142] – allogén csontszövet beültetése azonban nem mindig hozza meg a kívánt eredményt. A beültetett idegen csont sokszor nem degradálódik a megfelelő ütemben [145] és a „friss”, előkezeletlen allograft alkalmazása nagy kockázatot jelent a fertőző betegségek átvitele illetve 24 immunológiai szempontból is [146]. Ez mérsékelhető (de nem megszüntethető) a graft előkezelésével, ami azonban biológiai potenciáljának csökkenéséhez vezet [142]. 3. Táblázat Modern csontpótló graft-típusok Csontgraft Szintetikus graft PMMA Bioaktív Autograft Allograft

DBM Kollagén HA/TCP CaSO4 Kompozit kerámia + / ++ + 0 0 + ++ + / +++ ++ ++ OG,OI,OK OI,OK OI OK OK OK,OI(?) OK / 0 OG,OI,OK - Applikáció + ++ +++ +++ ++ ++ + / +++ ++ +++ Költség ++ ++ +/++ +/++ +/++ ++ + + +++ biokompatibil is, számos formula elérhető optimális degradálódás, gyors újcsontképződ és fogászati alkalmazás (PMMA alternatíváj a lehet) porosus osteokondu ktív anyagok + osteoindukt ív faktorok optimális applikáció, termikus és toxikus sejtkárosítás Biomechanika Biológia Megjegyzés elégtelen optimális revaszkularizá csont-graft csont-graft biológiai extenderké extenderké ció, tulajdonság immunológiai nt nt ok, limitált infektológai használható használható mennyiség veszély Jelmagyarázat: +: legkevésbé előnyös, +++: nagyon előnyös, 0: nincs, vagy nem értelmezhető, -: hátrányos, OG: oszteogén, OI: oszteoinduktív, OK: oszteokonduktív, DBM: demineralizált

csontmátrix, HA: hidroxiapatit, TCP: trikalcium-foszfát, CaSO4: kalcium-szulfát-dihidrát (gipsz), PMMA: polimetil-metakrilát csontcement A szintetikus graftok piacán számos csontpótló termék érhető el, azonban minden szempontból optimális csontpótló anyagot ez idáig nem sikerült kifejleszteni. A modern csontpótló eljárások folyamán négy alapvető tényezőt kell figyelembe vennünk a graft-típus megválasztásánál. Az egészséges csonthoz hasonló biomechanikai paraméterek (szakítószilárdság, rugalmasság, torziós tűrés stb.) elérése fontos kritérium a csontpótlásban. A biomechanikai konstelláció kialakulhat azonnal, a beültetést követően, illetve a rövid és a középtávú posztoperatív szakban. Ez utóbbi esetben a kívánt eredmény eléréséig külső vagy belső rögzítéssel kell biztosítani a fiziológiáshoz közeli mechanikai viszonyokat. A biomechanikai tényezők mellett az adott graftot jellemzi a biológiai

viselkedése. A csontpótlásban megkülönböztetünk oszteogén (általában oszteogén őssejtet tartalmazó), oszteoinduktív (mesenhymális őssejtet oszteogén differenciálódásra „bíró”) és oszteokonduktív (az újcsontképződést fizikailag támogató) tulajdonságokat. A biológiai jellemzők közé tartozik az adott graft biodegradálódási „képessége”, illetve toxicitása. A csontpótló graft megválasztásánál 25 figyelembe kell venni az adott anyag applikációs, műtéttechnikai tulajdonságait, valamint az alkalmazás költségvonzatát. Az applikációs kérdéskörbe beletartozik a graft nyerésének, a graft előkészítésének, a graft behelyezésének, és a graft posztoperatív „viselkedésének” folyamata, és ez szoros kapcsolatban állhat a költség-tényezővel, amelyet a graft-típus kereskedelmi ára mellett meghatároznak az applikációval járó financiális következmények is (pl. hosszabb műtéti idő, külső-, belső

kiegészítő rögzítés, hosszabb posztoperatív periódus). A demineralizált csontmátrix (DBM) és a különböző kollagén alapú készítmények közös jellemzője az előnyös applikálhatóság (formálható, illetve gél-szerű készítmények). Ennek ellenére biomechanikai hiányosságaik miatt inkább más - főleg auto- és allograftot felhasználó - csontpótló technikák kiegészítésére alkalmazhatók legjobb eredménnyel [147]. A kalcium foszfát vegyületeinek (hidroxi-apatit /HA/, trikalcium-foszfát /TCP/) alkalmazása kézenfekvő, hiszen a csontszövet szervetlen állományának kémiai összetételéhez ezek az anyagok állnak legközelebb (magas biokompatibilitás). Az alkalmazást azonban behatárolják a nem túl jó biomechanikai jellemzők (a porózus kiképzés biológiai előnyökkel, de a szilárdság csökkenésével jár), a gyakran előforduló lassú degradálódás és az applikációs megkötések [148]. A bioaktív kerámia (szilikát és

üvegszerű ionomer anyagok) illetve a kompozit (az egyes típusok előnyeit egyesítő) graftok lehetnek a jövő ideális csontpótló anyagai. Anyagi minőségtől függő jellemzőkkel bíró (sok esetben még kísérleti stádiumban lévő), drága graft-típusok, melyek főként a kisebb mennyiséget igénylő fogászati, szájsebészeti beavatkozásoknál vannak napjainkban használatban [149, 150]. A polimetil-metakrilát (PMMA) csontcementek nem tartoznak a csontpótló graftok közé, annak ellenére, hogy sokszor – előnyös árfekvésük és applikációs tulajdonságaik – alapján csontpótlást igénylő esetekben kerülnek implantációra. A közelmúlt kutatási eredményei azonban egyre több biológiai hátrányt (termikus sejtkárosítás, direkt toxicitás ) tárnak fel a PMMA-val kapcsolatban [136], várhatóan jelenlegi formájukban – a modern biokompatibilis graftok tökéletesedésével és térhódításával – a csontcementek a jövőben egyre inkább

ki fog szorulni a klinikai gyakorlatból. 26 2.61 A gipsz szerepe a csontpótlásban A gipsz (kalcium-szulfát-dihidrát, CaSO4 * 2H2O) jó degradálódási és biokompatibilitási jellemzőkkel bíró csontpótló graft, elterjedésének gátat szabnak az applikációval járó nehézségek, a viszonylag magas ár, és az eddig ismeretlen oszteológiai háttér (a kalcium-szulfát hatásmechanizmusáról nagyon kevés információ áll rendelkezésre). A múlt század második felében, Peltier és munkatársai [151] gyűjtöttek a csontpótlásra alkalmazott gipsz hatékonyságát és biztonságát alátámasztó széleskörű adatokat. A hazai tapasztalatokról – a gipsz ortopédiai alkalmazásával kapcsolatban – Dr. Riskó Tibor professzor tájékoztatta munkacsoportunkat A II világháborút követő időszakban, a csont-tuberkulózisban szenvedő betegek esetében sokszor a kitisztított tbc-s csontkavernát még képlékeny állapotú gipszmasszával töltötte fel.

Évekkel később készült röntgen felvételeken a feltöltött üregek helyét szabályos csont foglalta el. 2001-ben, Kelly és munkatársai [152] multicentrikus vizsgálatban alkalmaztak Osteoset®-et (sebészi minőségű kalcium-szulfát, Wright Medical Technology, Arlington TN) benignus tumor, trauma, ciszta által okozott csontdefektusok pótlására, összesen 109 esetben. Konklúzióként megállapították, hogy a kalcium-szulfát megbízható, kényelmesen és biztonsággal alkalmazható csontpótló graft. Az utóbbi években új indikációkban is alkalmazták a gipszet; Borelli és munkatársai [153] sikeresen kezelt 26 – súlyos, traumás csonttörést szenvedett – beteget autológ iliaca csontdarálmány és Osteoset® keverékével. 2005-ben közölték Chen és munkatársai [154] azt a tanulmányt, amely a kalcium-szulfát gerincsebészeti felhasználásának első leírása. Sikeresen kombinálták a lokálisan nyert autológ csontot Osteoset®-tel

poszterolaterális fúziós eljárásnál, jó fúziós arányt elérve. Az eredményes klinikai alkalmazás ellenére keveset tudunk a gipsz csontpótló anyagként történő alkalmazásának biológiai, élettani oldaláról. Kevéssé feltérképezettek azok a sejtélettani változások, amelyek együtt járnak a szintetikus graftok alkalmazásával, és nem teljesen ismertek azok a tulajdonságok, faktorok, amelyek az adott graftot az optimális csontpótlásra alkalmassá teszik. 27 3. Célkitűzések Kutatómunkánk során megvizsgáltuk, hogy a szarvas-modellben azonosított, a csontritkulás patomechanizmusában potenciális szereppel bíró gének allelikus variánsainak van-e hatása a csontdenzitásra és a törési rizikóra. Tanulmányoztuk, hogy a kompressziós csigolyatörések modern minimál invazív sebészi kezelésének gyakori, de kevéssé vizsgált szövődményeként jelentkező intradiszkális cementcsorgásnak van-e hatása a porckorong

biológiájára. Vizsgáltuk továbbá, hogy a csontpótlásban alkalmazott szintetikus graftok – és kiemelten a gipsz, mint számos előnnyel bíró, de kevéssé elterjedt csontpótló graft – milyen biológiai hatást gyakorolnak a csontsejtekre. Az alábbi kérdésekre kerestünk a választ kutatásunkban: 1. Van-e szignifikáns kapcsolat az ALPL, a FABP3, az FGFR1, az MMP2 és a TIMP2 gének egyedi polimorfizusai és a lumbális gerincen, a teljes femuron illetve a disztális radiuson mért csontdenzitás értékei között? 2. Befolyásolják-e az ALPL, a FABP3, az FGFR1, az MMP2 és a TIMP2 gének egyedi polimorfizusai a non-vertebrális törési rizikót? 3. Van-e kapcsolat az ALPL, a FABP3, az FGFR1, az MMP2 és a TIMP2 gének polimorfizmusaiból konstruált haplotípusok és a csontritkulást jellemző fenotípusok között? 4. Van-e olyan gén-gén interakció a fenti gének között, amely szignifikánsan befolyásolja a csontdenzitást, illetve a törési rizikót?

5. Befolyásolják-e a különböző anyagi minőségű vertebroplasztikás cementek a nucleus pulposus sejtek életképességét és osztódását? 6. Hatással vannak-e a vertebroplasztikás csontcementek a nucleus pulposus sejtek génexpressziós profiljára? 7. Képesek-e megtapadni és osztódni a gipszen – mint szintetikus csontpótló grafton – az MC3T3 preoszteoblaszt sejtek? 8. Hogyan befolyásolják a preoszteoblasztok osztódási képességét és génexpressziós profilját a különböző csontcementek és a magas kalciumkoncentráció? 28 4. Módszerek 4.1 A vizsgálati alanyok szűrése és beválogatása Háromszáz-hatvan posztmenopauzás nőt vontunk be a vizsgálatunkba, klinikánk oszteoporózis rendelésén keresztül. A vizsgálati alanyok első denzitometriás szűrésükre érkeztek a rendelésre. A fizikális vizsgálatot követően részletes kérdőívet töltött ki minden alany a családi anamnézis, korábbi betegségek és életmódi

szokások felmérése érdekében. A vizsgálatból kizártunk minden olyan személyt, akinek anamnézisében csontrendszeri-, metabolikus- vagy anyagcsere betegség, bármilyen krónikus betegség, hormonpótlás, szteroidkezelés, bármely csontmetabolizmust befolyásoló gyógyszer szedése, rendszeres alkoholfogyasztás (több mint két egység naponta) vagy 40 éves kornál előbb bekövetkezett menopauza szerepelt. Kóros vérkémiai paraméterekkel (ALP, TSH, PTH, D3) rendelkező személyeket nem vontunk be a vizsgálatba. A BMD értékeket a lumbális gerinc (L2-L4) és a teljes femur vonatkozásában Lunar Prodigy DXA készülékkel (GE Medical Systems, Diegem, Belgium), a radiust tekintve Norland pDEXA® denzitométerrel (CooperSurgical Inc, Trumbull, CT, USA) határoztuk meg. A csontritkulás (OP) diagnózisát a WHO kritériumnak megfelelően állapítottuk meg (Tscore < -2,5 bármely mért helyen). A vizsgálati alanyoktól részletes törési anamnézist vettünk fel,

és a non-vertebrális oszteoporotikus töréseket 45 éves kor után, kis traumára bekövetkező törésként definiáltunk a vizsgálatban (a koponya, ujjak és gerinc törését kizárva). Vertebrális kompressziós frakturák prevalenciáját nem mértük fel a vizsgálati populációnkban. A tudományos vizsgálatot az illetékes etikai bizottság engedélyezte (SE RKEB 6392–1/2004-1018EKU). A vizsgálati alanyok részletes tájékoztatását kaptak a vizsgálatról és beleegyező nyilatkozatot írtak alá. A vizsgálati populáció jellemzőit a 4. Táblázat foglalja össze 4.2 Gének és SNP-k kiválasztása Polimorfizmus-vizsgálatunkhoz öt – korábban az oszteoporózis kapcsán nem, vagy kevéssé vizsgált – gént választottunk ki az előzőleg elvégzett szarvas és humán in vivo génexpressziós vizsgálatok eredménye alapján [117, 118]. 29 4. Táblázat A vizsgálati populációt leíró adatok összesítése (N=353) Változó (mértékegység)

Életkor (évek) Menopauzális kor (évek) mean±SD (tartomány) 61,6±7,9# 13,5 (1-42) Magasság (cm) 158,1 (139-176) Testtömeg (kg) 68,9±12,1# Body Mass Index (kg/m2) 27,6±4,5# Dohányos (%) 45 (12,5%) Rendszeres alkoholfogyasztó (%)* 16 (4,5%) Kalcium bevitel (mg/nap) 642 (350-2000) Lumbális BMD (g/cm2) 0,887±0,176# Femur BMD (g/cm2) 0,785±0,168# Radius BMD (g/cm2) 0,689±0,161# Oszteoporózis diagnózisa (%) 198 (56%) Non-vertebrális oszteoporotikus törése volt (%) 76 (21,5%) * Az aktuális alkoholfogyasztás több, mint hetente 2 egység, de kevesebb, mint naponta 2 egység. #Az adott változó eloszlása nem különbözik szignifikánsan a normál eloszlástól (p>0,05 a Kolmogorov-Smirnov tesztben). A vizsgált gének az alkalikus foszfatáz (ALPL), mátrix metalloproteináz-2 (MMP2), metalloproteináz szöveti inhibitor-2 (TIMP2), fibroblaszt növekedési faktor receptor-1 (FGFR1) és zsírsav-kötő protein-3 (FABP3) génjei voltak.

Irodalmi adatok alátámasztották a gének csontmetabolizmusban játszott szerepét. A NCBI dbSNP és a HapMap adatbázisok használatával választottunk összesen 24 egypontos nukleotid polimorfizmust (SNP) a genotipizálásra az öt génben. Mivel az adott gének polimorfizmusainak hatásáról a csontritkulással kapcsolatban nem állt rendelkezésünkre adat, ezért a SNP-k kiválasztásánál több szempontot is figyelembe kellett vennünk: 1.) a GC arányt az adott SNP környezetében (40-60% közötti arány optimális a genotipizálás 30 szempontjából); 2.) a multiplex genotipizálási technika miatt C/T vagy A/G allélcserével járó polimorfizmusokat tudtunk egy rendszerben vizsgálni; olyan SNP-ket választottunk, amelyek 3.) a kaukázusi populációban validáltak; 4) a ritkább allél közölt frekvenciája (MAF) meghaladta az 5%-ot és 5.) próbáltunk a gének funkcionális szakaszaiban (promóter, exonok, 3’-vég) fekvő SNP-ket választani. A legtöbb

általunk választott SNP, a HapMap adatok alapján haplotípus-taggelő, vagy azzal szorosan kapcsolt polimorfizmus volt, de a gének teljes lefedését (taggelését) a 24 genotipizált SNP-pel nem tudtuk megoldani. Az „in silico” kapcsoltsági adatok alapján a genotipizált SNP-k 29%, 80%, 64%, 41% illetve 55%-os mértékben reprezentálják az ALPL, FABP3, FGFR1, MMP2 és TIMP2 gének (és upstream illetve downstream nem kódoló régióik) összes allelikus variánsát r2>0,8 valószínűséggel. A kiválasztott polimorfizmusok géneken belüli elhelyezkedését, kapcsoltsági viszonyait és populációs adatait mutatja az 7. Ábra és a 6 Táblázat rs243843 rs243866 rs8066116 rs4789939 rs4796812 rs9900972 rs9894295 5’ rs931227 3’ rs1384364 rs12677355 rs7825208 rs6996321 5’ rs2280846 3’ rs3925 3’ TIMP2 FGFR1 rs13317 5’ rs1030868 5’ rs10914367 rs951545 rs11578034 3’ rs3738099 rs1256341 3’ rs871132 5’ MMP2 rs243847 FABP3

rs11542001 ALPL 7. Ábra A genotipizált SNP-k elhelyezkedése az új kandidáns génekben és a polimorfizmusok közti kapcsoltsági viszony 31 4.3 DNS izolálás és genotipizálás az SNPstream rendszerrel A vizsgálati alanyoktól rutin vérvétel során nyert vénás vérből High Pure PCR Template Purification kittel (Roche, Indianapolis, IN, USA) extraháltunk nagy tisztaságú genomiális DNS-t. A nukleinsav minőségi és mennyiségi kontrollját NanoDrop B-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA) spektrofotméterrel végeztük, majd minden mintát 10 ng/ml-es koncentrációra higítottunk. A robosztus genotipizálás a Semmelweis Egyetem SNP Core Facility-jének keretein belül a nagy áteresztőképességű GenomeLab SNPstream® Genotyping System (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) rendszerben történt. Az automatizált genotipizáló rendszer multiplex polimeráz láncreakcióval (PCR) kapcsolt fluoreszcens jelölésen alapuló, array-rendszerű

egybázisos primer extenzió elvén működik [155]. Előnye, hogy rendkívül kis reagens mennyiségekkel, 384 lyukú plateken dolgozik, és egymással párhuzamosan határozza meg 12, illetve 48 SNP genotípusát minden mintában. Így nagyfokú idő- és költséghatékonyság valósítható meg a rendszerben, hozzátéve, hogy a kiemelkedően magas találati arány (succes rate) elérése csak gondos tervezést követően érhető el. Minden, a multiplex genotipizáláshoz szükséges PCR primer-t és extenziós primer-t – tehát gyakorlatilag a későbbi molekuláris biológiai folyamatot – a Beckman Coulter web-alapú primer tervező alkalmazásával (Autoprimer.com, http://wwwautoprimercom) terveztünk és „in silico” teszteltünk a reagensek megrendelése előtt. A genotipizálás lépései: 1.) Multiplex PCR a kiválasztott SNP-régiók amplifikálására. 2) Tisztítás (a feleslegben maradt primerek, dNTP-k, és egyszálú PCR termékek emésztése exonukleáz I és

shrimp alkalikus foszfatáz speciális keverékével). 3.) Allél-specifikus, fluoreszcens egybázisú primer extenzió 4) Az extenziós primerek SNP-specifikus 5’-ragadós végének segítségével a termékeket hibridizáltuk az ún. SNPware® Tag Array plate-hez. 5) Az array leolvasása két színű fluoreszcens detektálással, a SNPstream® Imager szoftverrel. 6) Adatelemzés és genotípus meghatározás a SNPstream® szoftverrel. A munkafolyamatot Biomek FX Dual Arm system (Beckman Coulter) pipettázó robotokkal tudtuk teljesen automatizálni. Tíz random mintát mértünk három párhuzamos futtatásban a technikai hibák tesztelése érdekében. 32 4.4 Nucleus pulposus sejtek izolálása, tenyésztése és kezelése Négy, a csigolyaközti porckorong protrúziójával operált fiatal férfibeteget (átlagéletkor±SD: 29±3,7 év) vontunk be a vizsgálatba (ETT TUKEB ad.506/KO/2005) A részletes tájékoztatást és az írásos belegyezést követően a

betegség gyógyítását célzó műtét során eltávolításra került porckorong szövetdarabot PBS-ben (phosphate buffered saline) megmostuk, majd steril tenyésztő médiumban haladéktalanul a laboratóriumba szállítottuk. Az annulus fibrosus és a nucleus pulposus (NP) szöveteit makroszkóposan szeparáltuk, majd az NP-t apró darabokra vágtuk. Az NP szövetdarabokat 1 órán át 0,2%-os pronáz-, majd további 2 órán át 1 mg/ml kollagenáz-diszpáz oldatban (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany) emésztettük 37°C-os rázófürdőben. Az izolált NP sejteket mikropórusú szűrőn átszűrtük, majd PBS-ben mostuk háromszor. A sejteket 10% borjúsavót, 25 μg/ml aszkorbinsavat és antibiotikumot tartalmazó DMEM/F12 sejttenyésztő médiumban (Sigma-Aldrich Inc., St Louis, MO, USA Inc, St Louis, MO, USA) tenyésztettük 37°C-on, 5% CO2-koncentráció és 85% páratartalom mellett, normál légköri nyomáson. A monolayer kultúrák első passzálását

követően végeztük a kísérletes kezeléseket, méréseket a sejteken. A szintetikus graftok hatásainak vizsgálata érdekében a sejteket olyan anyagokkal kezeltük, amelyek az adott szintetikus graft végleges in vivo kémiai formáinak megfelelő anyagminőségű. A PMMA-partikulumokat (Polysciences, Warrington, PA), a hidroxi-apatit (HA) és a kristályos kalcium-szulfát-dihidrát (gipsz) port (Sigma-Aldrich Inc., St Louis, MO, USA Inc, St Louis, MO, USA) 70%-os etanolban sterilizáltuk, majd PBS-ben mostuk át, végül 10%-os szuszpenziókat készítve. 4.5 MC3T3 sejtek tenyésztése különböző tenyésztő-felszíneken Az MC3T3 preoszteoblaszt sejteket négyféle felszínen tenyésztettük előzőleg preparált 6-lyukú műanyag sejttenyésztő plateken (TP). Minden plate esetén 1 kamra aljába polimetil-metakrilát (PMMA) korongot formáltunk extra alacsony viszkozitású 33 csontcementből (Cemex® XL – Tecres S.pA, Verona, Italy), 1 kamra aljába

gipszkorongot öntöttünk CaSO4*1/2 H2O (Sigma-Aldrich Inc., St Louis, MO, USA) és desztillált víz 50%-os szuszpenziójából, illetve 1 kamra aljába előzőleg sterilizált ásványi gipszlapot helyeztünk (ELTE Ásványtani Tanszék). A sejtek tenyésztéséhez 10% borjúsavót és antibiotikumot tartalmazó α-MEM médiumot alkalmaztunk. A médium standard Ca2+ és aszkorbinsav koncentrációja 1,8 mM és 25 μg/ml volt. Mivel előkészítő méréseink során megállapítottuk, hogy a sejtmentes gipszkorongok és az ásványi gipszlapok felett a médiumban – a kis mértékű disszociáció következményeként – 25,48±0,83 mM-os Ca2+-koncentráció alakul ki, ezért a műanyag plate-re szélesztett kultúrák harmadánál a 3 ml médiumot 150 μl, 0,5 M-os CaCl2 oldattal szupplementáltuk, a végső Ca2+ koncentrációt 25,5 mM-ra beállítva (TP25). A tenyészeteket 37°C-on, 5%-os CO2 koncentráció és 85%-os páratartalom mellett tartottuk fenn. 4.6

Sejtszám-meghatározás A szintetikus graftok NP sejtek életképességére gyakorolt hatását dózis- és kezelési idő függvényében vizsgáltuk. 5000 sejt/cm2 kiinduló sűrűségben tenyésztettük a NP sejteket 24 lyukú platen, majd a 4. napon graft-partikulákat (PMMA, HA és gipsz) adtunk a tenyészetekhez 0,05; 0,1; 0,2; 0,4 és 0,8 v/v % végkoncentrációban. A sejtszámot a kezelés 4. napján határoztuk meg A tenyészetek másik részét 0,1 v/v % graft-partikulával kezeltük a sejttenyésztés 1., 2, 3, 4 illetve 5 napján, a sejtszámot a 5. napon meghatározva Mindig meghatároztuk párhuzamos, kezeletlen kontroll kultúrák életképességét is. Az MC3T3 preoszteoblasztok osztódási képességét a különböző tenyésztési felszíneken 24 órás tenyésztési periódus két végpontjában határoztuk meg. A sejtszámolást minden esetben a CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega Co., Madison, WI, USA) segítségével végeztük A

tenyészetek óvatos PBS-es mosása után, a reagens és a tenyésztő médium 1:1 arányú elegyével rázatva inkubáltuk a plateket 10 percig, majd a felülúszó lumineszcenciáját, amely az ATP mennyiséggel és így az élő sejtek számával arányos, fluorométerrel határoztuk meg. 34 4.7 Alkalikus foszfatáz aktivitás és Ca2+-koncentráció meghatározás Az MC3T3-tenyészeteket 10 mM β-glicerol-foszfát és 25 μg/ml aszkorbinsav tartalmú oszteogén médiumban inkubáltuk 15 napig, majd a felülúszóból p-nitrofenilfoszfatát reakción alapuló ALP-meghatározást végeztünk Olympus AU2700 analizátorral (Olympus Life and Material Science Europa GmbH, Hamburg, Germany). Az ALP aktivitást az előzőleg CellLyticTM reagenssel (Sigma-Aldrich Inc., St Louis, MO, USA Inc., St Louis, MO, USA) emésztett tenyészetekből NanoDrop® ND-1000 spektrofotométerrel (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA), 280 nm-en meghatározott protein-koncentrációra

normalizáltuk. A médium Ca2+-koncentrációját a tenyészetek 3., 6, 10, 14 és 21 napján mértük meg o-krezolftalein-reakción alapuló módszerrel Olympus AU2700 analizátorral. 4.8 Génexpressziós vizsgálatok A génexpressziós vizsgálatok elvégzéséhez az NP sejteket 10000 sejt/cm2 sűrűségben tenyésztettük 6 lyukú sejttenyésztő plateken (Sigma), DMEM sejttenyésztő médiumban, standard körülmények között. A tenyésztés harmadik napján, a médium cserét követően a tenyészetek egy részét 0,1 v/v % koncentrációjú graft-partikulummal (gipsz, HA, PMMA) kezeltük, majd további 4 napig tenyésztettük a kolóniákat. Az MC3T3 preoszteoblaszt sejteket előzőleg preparált 6 lyukú műanyag platekre szélesztettük, 5000 sejt/cm2 sűrűségben. Minden plate tartalmazott 1 sejtmentes, 2 kontroll, 1 kalcium-szupplementált, 1 gipszkorongos és 1 PMMA-korongos tenyésztő kamrát. A sejteket 15 napig tenyésztettük standard körülmények

között Az NP sejttenyészetekből totál RNS-t izoláltunk QIAgen RNeasy Lipid Tissue (QIAGEN Sciences, Maryland 20874, USA) kittel. Az MC3T3-sejtekből az RNS izolálás High Pure RNA Isolation (Roche Diagnostics GmbH, Manheim, Germany) 35 kittel történt. Mindkét gyári RNS-izoláló kit nagy hatásfokú, nagy tisztaságú RNS izolálást tesz lehetővé, szilika-membrános oszlopos módszer segítségével. Az RNS integritást agaróz gélen, a mennyiséget és tisztaságot NanoDrop® ND-1000 spektrofotométerrel ellenőriztük. Tíz μl 25-50 ng/μl koncentrációjú totál RNS-t inkubáltunk 600 ng random hexamerrel 8 percig 65°C-on. A reverz transzkripcióhoz 200 U M-MLV reverz transzkriptázt, 100 nmol dNTP-t, 20 U Rnazin-t és 4 μl m-MLV 5x puffert (minden reagens Promega Co., Madison, WI, USA) adtunk a reakcióelegyhez, majd a 20 μl össztérfogatú elegyet 1 órán át 37°C-on inkubáltuk. A porckorong, illetve a csontszövet metabolizmusában jelentős szerepet

játszó gének (5. Táblázat) mRNS koncentrációját génspecifikus valós-idejű PCR technikával, az Applied Biosystem TaqMan® Gene Expression Assays rendszerével vizsgáltuk. A 20 μl-es végső reakcióelegy 1 μl cDNS-t, 10 μl TaqMan® 2x Universal PCR Master Mix NoAmpErase UNG-t, 1 μl előretervezett és validált génspecifikus TaqMan® Gene Expression Assay 20x-t és 8 μl desztillált vizet tartalmazott. Az amplifikációra ABI Prism 7500 real-time PCR rendszert (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) használtunk. A kiválasztott géneket minden sejtizolátumból három párhuzamos futtatásban vizsgálatuk 96 lyukú optikai platen a következő protokoll szerint: 10 perc denaturálás 95°C-on, majd 15 másodperc 95°C-os denaturáció és 1 perc 60 °C-os annelációextenzió ciklus 50-szer ismételve. A „háztartási” GAPDH gént használtuk endogén kontrollnak minden esetben. A relatív kvantifikációs adatokat a 7500 System SDS szoftver 1.3 verziójának

segítségével gyűjtöttük A génexpressziós vizsgálatokat az izolált NP sejtekből még az in vitro tenyésztést megelőzően is elvégeztük, hogy az in vitro körülmények hatását is meg tujduk vizsgálni a sebészileg eltávolított szövetminták esetén. 4.9 Statisztikai módszerek 4.91 Leíró statisztikai módszerek 36 A polimorfizmus vizsgálatok esetében kizártuk a további adatfeldolgozásból azokat a személyeket, akik 20-nál kevesebb sikeresen genotipizált lókusszal rendelkeztek (azaza sikerességi ráta 85% alatt volt). Az adatbázisban a hiányzó genotípusokat a „10-legközlebbi szomszéd módszer” (10-nearest neighbor method) [156] segítségével determináltuk a genotipizálási hibákból eredő fals eredmények elkerülése érdekben. A „Haploview 30” [157] szoftver segítségével végeztük a genotipizálás leíró elemzését (6. Táblázat) Az 5%-nál kisebb MAF-fal rendelkező és a Hardy-Weinberg disequilibriumban

(Khi-négyzet próba p-értéke < 0,05) lévő SNP-ket kizártuk a további elemző statisztikából. Az SNP-k közti kapcsoltsági viszonyt (LD) szintén a „Haploview” szoftverrel határoztuk meg. A vizsgálati populációt az anamnesztikus és a denzitometriás adatok alapján jellemeztük (4. Táblázat) A csontdenzitás (BMD) értékre és a csonttörése szignifikáns kovariánsokat regressziós analízis segítségével szűrtük ki. A stepwise módszerrel kiszámított – a kovariánsokkal normalizált fenotípusokat leíró – regressziós reziduálisokat alkalmaztuk a további elemző statisztikák során [158]. 4.92 Elemző statisztikai módszerek A humán genetikai asszociációs vizsgálatokat a „PedGenie” szoftver felhasználásával végeztük [159]. A statisztikai szoftver ANOVÁ-val ekvivalens elemzést végez három genetikai modellben (additív, domináns, recesszív). Az alkalmazás „Quantitativ” és „OddsRatio” opcióját alkalmaztuk

vizsgálatunkban és az eredmények megbízhatóságának megőrzése érdekében empirikus p-értéket generáltunk 10000 Monte-Carlo permutációs próba futtatásával. Statisztikailag szignifikánsnak a permutált p-érték 0,05-nél kisebb értékét tekintettük. Az individuális SNP-analízis statisztikai erejét (power of the study) a Quanto szoftver 1.1 verziójával számoltuk ki [160]. A genetikai eredményekből haplotípus analízist is végeztünk az R-statisztikai környezetbe épülő „haplo.stats” szoftver felhasználásával (http://cranr-projectorg) Csúszó-ablak analízis segítségével konsturáltuk a 2, 3 és 4 SNP-ből álló haplotípusokat az egyes géneken belül, majd score-statisztika alkalmazásával határoztuk meg az egyes haplotípusok és a fenotípusok kapcsolatát [161]. A score-statisztika permuált p-értéket 37 számít a globális összefüggés és az egyes haplotípusok szerepének jellemzésére. A haplotípusok egyedi hatását

regressziós modellben a szoftverbe épített „haplo.glm” funkcióval határoztuk meg. Végül vizsgálatunkban feltérképeztük a gén-gén interakciók (G x G) szerepét a csontritkulást jellemző fenotípusokkal összefüggésben. A G x G interakciókat a genetikai vizsgálatokra fejlesztett „SNPassoc” szoftverrel [162], loglikelihood ratio (LRT) teszt alkalmazásával térképeztük fel. A szoftver grafikusan jeleníti meg az egyes SNP-kombinációk közti, az adott fenotípusra vonatkozó interakciós kapcsolat p-értékét. A fals pozitív eredmények elkerülése érdekében, csak az erősen valószínű, 0,001-nél kisebb p-értékkel jellemzett interakciókat választottuk ki, majd a SNP-kombinációkat regressziós modellbe illesztve validáltuk a G x G interakciót. A validálás során p<0,01 értékkel rendelkező interakciókat tekintettük szignifikánsnak. A regressziós analíziseket az „SPSS 150 for Windows” (SPSS Inc, Chicago, USA) statisztikai

szoftverkörnyezetben végeztük. Az in vitro mérések adatait szintén az „SPSS” szoftverrel elemeztük. A mérési eredmények minden esetben legalább négy független sejtkultúra adatait tükrözik és a két mintás összehasonlításokra non-parametrikus Mann-Whitney U-tesztet alkalmaztunk, 10000 Monte-Carlo permutációval kapcsoltan. Szignifikáns értéknek a 0,05-nél kisebb permutált p-értéket tekintettük. A génexpressziós analízisek során a 2szeresnél nagyobb expressziós különbségeket tekintettük pozitív eredménynek 4.93 Szekvencia analízis A genotipizált SNP-k környezetének genomiális szekvenciáit az NCBI dbSNP adatbázisból nyertük (http://www.ncbinlmnihgov/SNP) A két különböző allélt tartalmazó DNS szekvenciákat „in silico” elemzésnek vetettük alá a lehetséges transzkripciós faktor kötőhelyek feltérképezése érdekében. Az analízisre a TRANSFAC adatbázist használó „PROMO” web-alapú alkalmazást

használtuk (http://alggen.lsiupces) [163] 38 5. Táblázat A génexpressziós vizsgálatok során alkalmazott TaqMan® Assay-k Assay ID* GÉN Protein Funkció Hs00202971 m1 AGC1 aggrekán Extracelluláris mátrix glikoprotein Mm01741771 g1 BGLAP bone gamma-carboxyglutamate protein (osteokalcin) Kalcium-kötő fehérje BGN biglikán Extracelluláris mátrix struktúr-fehérje Hs00154192 m1 BMP2 csont morfogenetikus protein-2 Szignál-molekula / TGFβ-család Mm00432087 m1 BMP4 csont morfogenetikus protein-4 Szignál-molekula / TGFβ-család Mm00432109 m1 BMP8a csont morfogenetikus protein-8a Szignál-molekula / TGFβ-család Mm00492555 m1 BSP csont szialoprotein Extracelluláris mátrix struktúr-fehérje Mm00443375 m1 CASR Kalcium-szenzor G-protein kapcsolt receptor COL1A1 I. típusú kollagén, alpha 1 lánc Extracelluláris mátrix struktúr-fehérje COL1A2 I. típusú kollagén, alpha 2 lánc Extracelluláris mátrix struktúr-fehérje

COL2A1 II. típusú kollagén, alpha 1 lánc Extracelluláris mátrix struktúr-fehérje DCN dekorin Extracelluláris mátrix struktúr-fehérje FN1 fibronektin-1 Extracelluláris mátrix kötő-fehérje GAPDH glicerinaldehid-3-foszfátdehidrogenáz dehidrogenáz, endogén kontroll IL1a interleukin-1, alpha Szignál-molekula / Interleukin MMP2 mátrix metalloproteáz-2 (zselatináz) Metalloproteáz Hs00233992 m1 MMP13 mátrix metalloproteáz-13 (kollagenáz) Metalloproteáz Mm00489637 m1 SMAD3 MAD homolog-3 (Drosophila) Transzkripciós faktor / TGFβ család Mm00484738 m1 SMAD6 MAD homolog-6 (Drosophila) Transzkripciós faktor / TGFβ család Hs00165814 m1 SOX9 SRY-box-9 Transzkripciós faktor Hs00234278 m1 TIMP2 metalloproteáz szöveti inhibítor-2 Metalloproteáz inhibítor Mm00455918 m1 Hs00156076 m1 Mm00801666 g1 Hs00164004 m1 Mm00483888 m1 Mm00491889 m1 Hs00156568 m1 Mm00514535 m1 Hs00266491 m1 Mm01256734 m1 Hs00277509 m1 Mm99999915 g1

Hs99999905 m1 Hs00174092 m1 Mm00439498 m1 Hs00234422 m1 *A “Hs” (Homo sapiens) kezdetű kódok a human, míg az “Mm” (Mus musculus) kezdetű kódok az egér génexpressziós assay-ket jelölik. A kódok alapján rendelhető reagens-szettek tartalmazzák a PCR reakcióhoz szükséges génspecifikus primereket és fluoreszcens jelzésű próbákat, melyek pontos szekvenciáját a gyártó nem hozza nyilvánosságra. 39 5. Eredmények 5.1 Új génpolimorfizmusok kapcsolata a csontritkulással 5.11 A vizsgálat egyes paramétereit leíró statisztikai analízisek eredményei A SNPstream® genotipizálási módszer technikai pontossága 100%-os volt vizsgálatunkban, azaz a párhuzamosan genotipizált minták eredményeiben nem volt eltérés. Hét személyt zártunk ki a vizsgálati populációból, mivel az ő sikerességi rátájuk 85% alatti volt. A ritkább allél gyakorisága az MMP2-ben található rs11542001 esetén 5%-nál kisebb volt, illetve két SNP

(rs11578034 a FABP3-ban és rs243843 az MMP2ben) Hardy-Weinberg disequilibriumban volt (6. Táblázat), ezért ezeket a polimorfizmusokat kizártuk a további adatelemzésből. A végső adatbázisunk tehát 21 SNP és 353 személy adatait tartalmazta. Ebben az adatbázisban összesen 54 genotípus hiányzott, amelyeket statisztikai módszerrel pótoltunk. Az életkor, a menopauzális kor és a body mass index (BMI) bizonyultak a csontdenzitásra szignifikáns „környezeti” faktornak. A non-vertebrális törési rizikót az életkor, a BMI és a BMD-k befolyásolták szignifikánsan. 5.12 Asszociációs vizsgálatok Jelen vizsgálatunkban csak azokat a statisztikailag szignifikáns összefüggéseket fogadtuk el és értelmeztük, ahol a vizsgálat statisztikai ereje 80%-ot meghaladónak bizonyult. A lumbális BMD-re (mean±SD = 0,887±0,176 g/cm2) vonatkoztatva, 0,055 g/cm2-es domináns genetikai hatás a 353 fős mintában 83%-os erősséggel detektálható, MAF =

0,322 esetén. A femur BMD-t (mean±SD = 0.785±0168) tekintve, 82%-os erősséggel tudtunk 0,157 g/cm2-es recesszív genetikai hatást kimutatni MAF = 0,166 esetén. A törési rizikó esetén, a vizsgálati populáció mérete (76 eset – 277 kontroll) 86%-os statisztikai erőt biztosított 2,06-os esélyhányados (O.R) kimutatására, MAF = 0,184 esetén, domináns modellben. 40 6. Táblázat A genotipizálás leíró statisztikáinak összesítése GÉN Allélok SNP pozíciója SNP típusa Sikerességi ráta HW p-érték MAF rs871132 G/A chr1:21607931 intron 97,4% 0,509 0,116 rs1256341 G/A chr1:21612135 intron 100% 0,822 0,305 rs3738099 G/A chr1:21640041 exon(263Y/H) 100% 0,086 0,113 rs11578034 C/T chr1:31511246 intron 99,7% 0,003 0,055 rs951545 C/T chr1:31513758 intron 99,1% 1,0 0,119 rs10914367 G/A chr1:31515299 promóter 100% 0,716 0,166 rs13317 C/T chr8:38388671 3’ UTR 99,1% 0,646 0,212 rs3925 G/A chr8:38400815

intron 97,4% 0,942 0,204 rs2280846 G/A chr8:38401451 intron 100% 1,0 0,082 rs6996321 G/A chr8:38441503 intron 98% 0,506 0,322 rs7825208 G/A chr8:38446444 promóter 99,1% 0,362 0,137 rs12677355 C/T chr8:38449100 promóter 100% 0,921 0,350 rs243866 G/A chr16:54069038 promóter 100% 0,701 0,262 rs1030868 C/T chr16:54074268 intron 97,7% 0,747 0,390 rs11542001 C/T chr16:54077073 exon(239F/L) 99,4% 1,0 0,000 rs243847 C/T chr16:54081499 intron 99,7% 0,919 0,317 rs243843 G/A chr16:54084799 intron 100% 0,004 0,156 rs1384364 C/T chr17:74364423 intron 99,7% 1,0 0,195 rs931227 G/A chr17:74370134 intron 98,8% 0,697 0,173 rs9894295 G/A chr17:74373700 intron 100% 0,063 0,122 rs9900972 G/A chr17:74380209 intron 99,7% 0,720 0,184 rs4796812 C/T chr17:74386781 intron 99,7% 0,656 0,058 rs4789939 G/A chr17:74393298 intron 100% 1,0 0,133 rs8066116 C/T chr17:74441474 promóter 98,8% 0,064 0,119

SNP jelölése ALPL alkalikus foszfatáz FABP3 zsírsavkötő protein-3 FGFR1 fibroblaszt növekedési factor receptor-1 MMP2 mátrix metalloproteáz-2 TIMP2 metalloproteáz szöveti inhibítor-2 A sikerességi ráta az egyértelműen megállapított genotípusok százalékát jelöli. A HW p-érték jelöli a Hardy-Weinberg equilibrium megállapítására alkalmazott Khi2-teszt szignifikancia-szintjét. A MAF a ritkább allél előfordulási gyakoriságát jelzi 41 Az FGFR1-ben található rs6996321 SNP szignifikáns kapcsolatot mutatott a lumbális BMD-vel (a mean BMD±SE 0,858±0,013; 0,912±0,015 és 0,916±0,029 a G/G, A/G és A/A genotípusok esetén). A korrigált BMD értékek szignifikáns különbséget mutattak a domináns genetikai modellben (a korrigált BMD átlagértékek 0,031±0,011 és 0,031±0,011 g/cm2 voltak a G/G és a A/G+A/A csoportok esetén, p=0,002) (8. Ábra) A FABP3-ban található rs10914367 polimorfizmus homozigóta recesszív genotípusa

szignifikánsan magasabb BMD-t eredményezett a teljes femur tekintetében (a mean BMD±SE 0,783±0,009; 0,776±0,028 és 0,945±0,029 volt a G/G, A/G és A/A genotípusokban, míg a korrigált BMD különbségek a recesszív modellben 0,004±0,008 és 0,143±0,037 voltak a G/G+A/G és az A/A csoportokban, p=0,028) (8. Ábra). 8. Ábra Egyedi SNP-k összefüggése a csontdenzitással (mean±SE) 7. Táblázat Az rs9900972 TIMP2 polimorfizmus összefüggése a törési rizikóval Genotípus Nkontroll Neset O.R (95% CI) G/G 196 41 1,00 A/G + A/A 81 35 2,06 (1,12 - 3,58) p-érték 0,018 A kontrollok és esetek száma az oszteoporotikus törést szenvedő és nem szenvedők számát jelöli. Az esélyhányados (OR) és a 95%-os konfidencia intervallum mellett a permutált pértéket tüntettük fel 42 A non-vertebrális törési rizikó és az rs9900912 TIMP2 polimorfizmus szignifikáns kapcsolatát mutatja a 7. Táblázat A recesszív allélt („A”) hordozók

esetében a törési rizikó kétszerese volt a homozigóta domináns csoporttal szemben (p=0,018). A „haplo.stats” program segítségével azonosítottunk egy 4 lókuszból (rs13317, rs3925, rs2280846 és rs6996321) felépülő haplotípust az FGFR1 génben, amely szignifikánsan összefüggött a lumbális BMD-vel (a globális összefüggés permutált pértéke 0,007 volt) A gyakori TCGG haplotípus a szignifikánsan alacsonyabb, míg egy ritkább (CTGA) haplotípus a szignifikánsan magasabb BMD prediktorának bizonyult (8. Táblázat) 8. Táblázat Az FGFR1 haplotípus összefüggése a lumbális csontdenzitással Score teszt GLM modell p-érték* Koeficiens±SE p-érték# - 2,934 0,003 - 0,032±0,016 0,042 0,206 1,062 0,309 0,023±0,017 0,167 CTGA 0,107 2,595 0,012 0,069±0,022 0,002 Ht4 CTGG 0,083 - 1,121 0,269 - 0,016±0,028 0,568 Ht5 TCAG 0,078 0,964 0,346 0,034±0,026 0,189 Haplotípusok Szekvenciák Frekvenciák Ht1 TCGG 0,506 Ht2

TCGA Ht3 Hap-Score Az 5%-nál gyakoribb haplotípusok és a korrigált lumbális BMD-re gyakorolt egyedi hatásuk láthatók a táblázatban. A globális összefüggést jellemző permutált p-érték 0,007 volt *A score teszt p-értékeit 10000 permutációs próba eredményezte. #A GLM-modelben szereplő p-értékek a regressziós változókra vonatkozó t-statisztika szignifikanciáját jelölik. A haplotípusok egyedi hatását a regressziós koeficiensek demonstrálják. Mivel a haplotípust felépítő egyik SNP (rs6996321) önállóan is szignifikáns kapcsolatot mutatptt a lumbális csontdenzitással, ezért további elemzéseket végeztünk az összefüggés mélyebb rétegeinek feltárása érdekében. Log-likelihood (valószínűséghányados) analízissel az rs6996321 hatása konstansnak bizonyult az egyes haplotípusokban. Az rs6996321 hatása nem különbözött szignifikáns mértékben a TCG(Ht1-Ht2) és a CTG- (Ht4-Ht3) sturktúrákat összehasonlítva

(Khi2=2,38, df=2, p>0,25) Szintén összehasonlítottuk a két különböző rs6996321 allél (aláhúzva) hatását az átfedő haplotípusokban, amelyek nem mutattak szignifikáns különbséget a Ht1 (TCGG) és a Ht2 (TCGA) (Khi2=1,48, df=2, p>0,25) illetve a Ht4 (CTGG) és Ht3 (CTGA) 43 (Khi2=5,6, df=2, p>0,05) összevetésekben. A fenti tesztek segítségével bizonyítottuk, hogy az elemzett FGFR1 haplotípus a lumbális BMD önálló genetikai prediktora és a szignifikáns összefüggés nem az rs6996321 egyedi hatását tükrözi. 5.13 Gén-gén interakciók elemzése Azonosítottunk vizsgálatunkban olyan gén-gén interakciókat, amelyek az LRT analízis során szingifikáns összefüggést mutattak a csontdenzitással vagy a törési rizikóval (p1<0,001). Az LRT analízisek eredményét demonstrálja a „SNPassoc” szoftver grafikai output-ja (9. Ábra) A fals pozitív eredmények elkerülése érdekében, a regressziós analízissel végzett

validálási eljárást követően csak azokat az interakciókat tekintettük szignifikáns összefüggéseknek, ahol a regresszióban kapott interakciós pérték szintén alacsony volt (p2<0,01). A 9 Táblázat mutatja azokat a SNP-SNP kombinációkat, ahol az interakció szignifikánsnak bizonyult vizsgálatunkban. Szignifikáns G x G interakciót találtunk a FABP3 és az MMP2 (rs10914367 és rs1030868) között a lumbális BMD-t tekintve. Az ALPL és a TIMP2 közötti interakció szignifikánsnak bizonyult a femur (rs3738099 és rs9894295) és a radius (rs871132 és rs9894295) denzitás esetében. Az MMP2 és a TIMP2 (rs243847 és rs931227) között szignifikáns interakciót azonosítottunk a non-vertebrális törési rizikót figyelembe véve. 9. Ábra Az LRT analízis eredménye a lumbális csontdenzitásra A „SNPassoc” szoftver által generált reprezentatív ábra a SNP-SNP interakciókra vonatkozó likelihood ratio tesztek (LRT) p-értékeit mutatja. A sötétebb

szín magasabb szignifikancia-szintet jelöl. Az átlóban elhelyezkedő négyszögek jelölik az egyedi SNP-k hatásának szignifikancia-szintjeit. A mátrix felül elhelyezkedő háromszögében találhatók az interakciók (episztázis) szignifikancia-szintjei, míg az alsó háromszög a SNP-SNP interakciókat a legjobb egyedi SNP hatással összehasonlító LRT p-értékeit reprezentálja. 44 9. Táblázat A. Csontdenzitásra szignifikáns, validált gén-gén interakciók Lumbális BMD FABP3 p1=0,0006 rs10914367 p2=0,003 mean±SE (n) G/G MMP2 rs1030868 A/G A/A C/C 0,922±0,020 (86) 0,871±0,026 (41) 0,812±0,104 (3) C/T 0,869±0,014 (120) 0,902±0,028 (44) 1,021±0,089 (8) T/T 0,831±0,028 (41) 1,031±0,087 (10) (0) Femur BMD ALPL p1=0,0008 rs3738099 p2=0,003 mean±SE (n) A/A-G/G A/G TIMP2 C/C 0,801±0,011 (242) 0,746±0,022 (70) rs4796812 C/T 0,727±0,019 (30) 0,829±0,052 (11) Radius BMD ALPL p1=0,0008 rs871132 p2=0,008 mean±SE (n)

G/G A/G A/A TIMP2 A/A 0,695±0,012 (203) 0,671±0,023 (63) 0,483±0,000 (1) rs9894295 A/G 0,668±0,022 (70) 0,768±0,057 (15) 1,210±0,000 (1) B. Non-vertebrális törési rizikóra szignifikáns, validált gén-gén interakció Törési rizikó MMP2 p1=0,0006 rs243847 p2=0,004 O.R (95% CI) T/T TIMP2 rs931227 C/T C/C G/G 1,00 0,79 (0,39-1,60) 0,43 (0,13-1,38) A/G 0,06 (0,01-0,47) 1,91 (0,79-4,61) 0,91(0,27-3,10) A/A 0,00 (0,00) 0,66 (0,04-11,7) 0,47(0,04-5,65) Azokat a gén-gén interakciókat tekintettük szignifikánsnak, ahol az LRT analízis során a p-érték 0,001-nél kisebbnek (p1) bizonyult és a validálási eljárás során a szintén magas szignifikanciaértéket kaptunk (p2). 45 5.2 A szintetikus csontpótló graftok alkalmazásának molekuláris biológiai aspektusai 5.21 A szintetikus graftok hatása a nucleus pulposus (NP) sejtek életképességére A növekvő dózisú graft-partikulum kezelés hatását mutatja a 10/A. ábra

A PMMA alapú csontcement szignifikánsan csökkentette az életképes NP sejtek számát a tenyészetekben, az alkalmazott 0,05 – 0,1 – 0,2 – 0,4 – 0,8%-os kezelésnek megfelelően, 24,6 – 49,6 – 49,6 – 51,2 – 50,3%-kal. Sejtszám-csökkentő hatást mértünk a HA alapú graft esetén is, a kezelés koncentrációjától függően a sejtszám 55,3 – 64,4 – 64,9 – 71,8 – 68,7%-kal redukálódott. A gipsz alapú csontpótló graft experimentálisan kizárólag az alkalmazott legmagasabb (0,8%-os) koncentrációban befolyásolta negatívan az élő sejtek számát a tenyészetekben, és a 0,05%-os kezelés esetén a sejtszám szignifikáns növekedését detektáltuk a kezeletlen tenyészetekhez képest. Az azonos dózisú kezelések eredménye szignifikáns különbséget mutatott a különböző graft-típusok alkalmazásától függően. A PMMA hatása szignifikánsan különbözött a HA és a gipsz hatásától a 0,05 – 0,1 – 0,2%-os, illetve a 0,05 –

0,1 – 0,2 – 0,4%-os kezelések esetében. A HA és a gipsz kezelés minden koncentrációban szignifikánsan különböző sejtszámot eredményezett. A szintetikus töltőanyagok sejtszámra gyakorolt hatását a kezelési idő függvényében is vizsgáltuk. A 0,1%-os PMMA-koncentráció 75,2 – 79 – 78,2 – 68,4 – 72%-os sejtszám-redukciót eredményezett a NP-sejttenyészetekben az 1 – 2 – 3 – 4 – 5 napos kezelést követően (10/B. Ábra) A 0,1%-os HA-kezelés szintén szignifikánsan csökkentette a sejtszámot, a 2 – 3 – 4 – 5 napos tenyészetekben, 40,2 – 46,5 – 51,5 – 53,5%-os mértékben. A 0,1%-os gipsz kezelés nem befolyásolta szignifikáns mértékben az életképes NP-sejtek számát. A PMMA és a gipsz kezelés, illetve a PMMA és a HA kezelés hatása minden esetben szignifikánsan különbözött. A gipsz és a HA hatása a 3 – 4 – 5 napos tenyészetekben volt eltérő. 46 10. Ábra A sejtszám változása az alkalmazott dózis

(A) és a kezelési idő (B) függvényében (mean±SD) A. 140 Relatív sejtszám (%) 120 100 PMMA GIPSZ 80 HA 60 40 20 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,8 Koncentráció a médiumban (v/v %) B. 140 Relatív sejtszám (%) 120 100 PMMA 80 GIPSZ HA 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 Kezelés ideje (nap) A kitöltött szimbólummal jelölt mérési értékek szignifikáns különbséget jelölnek a kezeletlen kontroll sejttenyészethez képest. 47 5.22 Génexpressziós változások a csontpótló anyagok hatására izolált nucleus pulposus sejtekben 12 gén kifejeződésének változását vizsgáltuk az izolált NP sejtekben különböző csontpótló graftokkal való 0,1%-os, 4 napos kezelést követően (11. ábra) Az aggrekán (AGC1) expressziója mindhárom kezelést követően csökkent, 2,5 – 6,6 – 6,4-szeres csökkenést detektáltunk a PMMA – HA – gipsz kezelés eredményeként. A PMMA hatása az AGC1 expresszióra szignifikánsan különbözött a HA és a

gipsz kezelés hatásától. Az I típusú kollagén (COL1A1) expresziója csökkent a PMMA (2-szeres) és a gipsz (4,7-szeres) tenyészetekben, míg a HA nem befolyásolta szignifikánsan a gén expresszióját. A II típusú kollagén (COL2A1) expresszióját nem tudtuk mérni az in vitro tenyészetekben. A biglikán (BGN) expressziójára negatív hatással volt a HA és a gipsz kezelés (8,7-szeres és 5,4-szeres redukció) és az expressziós különbségek szignifikánsak voltak a PMMA-kezelés hatásával összehasonlítva. A dekorin (DCN) specifikus mRNS csökkent mennyiségét mértük a HA és a gipsz kezelést követően (2,5-szeres csökkenés mindkét esetben), míg a fibronektin-1 (FN1) expresszióját a graft-anyagok nem befolyásolták számottevő mértékben. A zselatináz (MMP2) legalacsonyabb mértékben a HA-kezelt kultúrákban expresszálódott, és ez a különbség szignifikánsnak mutatkozott a PMMA-val kezelt kultúrákban mért expressziós szinthez

viszonyítva. A kollagenáz (MMP13) nem expresszálódott a HA-vel kezelt sejtekben. Nem mértünk szignifikáns eltéréseket a metalloproteáz szöveti inhibítor-2 (TIMP2) expresszióban. A csont morfogenetikus protein-2 (BMP2) kifejeződésének szintjét magasabbnak találtuk a gipsz- és a HA-kezelt tenyészetekben (4,1-szeres, illetve 9,3szoros növekedés a kezeletlen sejtekhez képest és 2,6-szoros illetve 6,6-szoros túlexpresszió a PMMA-kezeléshez képest). Az interleukin-1-alpha (IL-1A) nem expresszálódott a gipsz-szel kezelt tenyészetekben és szignifikánsan magasabb expresszióját mértük a HAkezelt NP sejtekben (5,3-szoros növekedés). A SOX9 gén átíródását a PMMA-kezelés szignifikánsan gátolta (3,3-szoros csökkenés), míg a HAkezelés stimulálta (5,8-szoros növekedés). A gipsz nem befolyásolta a SOX9 48 expresszióját a kezeletlen sejtekhez viszonyítva, de szignifikáns különbség mutatkozott a HA/gipsz- és a PMMA-kezelés

hatása között (19,1-szeres illetve 2,3-szoros expressziós csökkenés a PMMA-kezelt tenyészetekben). 11. Ábra A génexpressziós változások az alkalmazott vertebroplasztikás töltőanyag 10 lg(NP-hez viszonyított génexpresszió) lg(NP-hez viszonyított génexpresszió) anyagi minőségétől függően (mean±SD) * 1 * # # * * § 0,1 AGC1 AGC1 COL1A1 COL1A1 10 # 1 # * # * # * 0,1 COL2A1 COL2A1 BGN BGN DCN DCN FN1 FN1 10 lg(NP-hez viszonyított génexpresszió) lg(NP-hez viszonyított génexpresszió) # # 1 § 0,1 MMP2 MMP2 MMP13 MMP13 PMMA * * # * # 1 * § 0,1 BMP2 BMP2 TIMP2 TIMP2 NP # * 10 GIPSZ IL-1A IL-1A SOX9 SOX9 HA Minden gén expressziója az adott sejttenyészetben mért GAPDH expresszióra volt normalizálva, és a kezeletlen tenyészetekben (NP) mért expresszióhoz viszonyítottuk. *: szignifikáns eltérés a kezeletlen (NP) sejtekhez képest, #: szignifikáns különbség a PMMA-val kezelt sejtekhez

képest, §: az adott gén expressziója nem volt mérhető a tenyészetben 5.23 Az MC3T3 preoszteoblasztok alakja, osztódása és a médium alkalikus foszfatáz aktivitása különböző tenyésztő felületeken A gipszkorongon tenyésztve a preoszteoblasztok életképesek maradtak és proliferáltak, hasonló mértékben, mint a Ca2+-szupplementált műanyag tenyésztő platek esetében (12. Ábra) A 24 órás inkubációs periódus alatt a proliferációs arány a gipsz-en (1,89±0,091) szigifikánsan magasabb volt, mint a PMMA-n (p<0,01), ahol a 49 sejtosztódás gátlását tapasztaltuk (0,914±0,052). A Ca2+-szupplementált tenyésztőplaten (TP25) a gipszhez hasonló proliferációt mértünk (2,07±0,06). 12. Ábra Az MC3T3 sejtek számának A sejtszám változása különböző felületeken változása 24 órás inkuációs periódus A sejtszám változása 24 óra alatt alatt (mean±SD, *: p<0,01) 250% * 200% 150% 100% 50% 0% GIPSZ TP25 PMMA 13.

Ábra Az MC3T3 sejtek morfológiája gipszen (A-B), ásványi gipszlapon (C), PMMA-n (D) és tenyésztő platen – 25,5 mM (E) és 1,8 mM (F) Ca2+-koncentráció melett (3 napos tenyészetek, hematoxylin festés) 100 μm 100 μm A D 25 μm 100 μm B E 250 μm 100 μm 50 C F Az MC3T3-sejtek jól tenyészthetőnek bizonyultak tenyésztő platen magas Ca2+koncentráció mellett és gipszkorongon. A sejtek alakja standard körülmények között kuboidális, míg a gipszkorongokon inkább hosszúkás, elnyújtott volt. Hasonló morfológiát tapasztaltunk a Ca2+-szupplementált, műanyag plates tenyészetekben. Az ásványi gipszlapon nem tudtak a preoszteoblasztok kitapadni és osztódni, míg a PMMA korongon sejtdegeneráció és nekrózis jeleit láttuk (13. Ábra) Az alkalikus foszfatáz mérések során megnövekedett aktivitást találtunk a gipszkorongok és a Ca2+-szupplementált médiumokban, a PMMA-felszínnel és a standard médiummal összehasonlítva (14/A

Ábra). Az ALP-aktivitást 23,14±4,55 U/gnak mértük a gipsz-en, ami szignifikánsan magasabbnak bizonyult a tenyésztő platen mért értéktől (TP: 4,44±0,52 U/g), de nem különbözött a Ca2+-szupplementált médiuban mért ALP aktivitást (TP25: 30,07±3,04 U/g). Szignifikáns, mintegy 6-szoros különbséget mértünk a gipsz-en és a PMMA-n tenyésztett sejtek ALP-aktivitása között (PMMA: 4,08±0,62 U/g). A 15 napos tenyészetekben a SMAD3 gén expressziója hasonló arányban változott (14/B Ábra). A SMAD3 expressziót a gipsz felületen 2,2-szer nagyobbnak mértük, mint a PMMA- és 2,6-szor magasabbnak, mint a tenyésztő platen (p<0,01). A 25 mM-os Ca2+-szupplementáció esetében szintén magas SMAD3 expresziót detektáltunk. 5.24 A gipsz felület és a magas Ca2+ koncentráció hatása a preoszteoblasztok génexpressziós profiljára A 15 napos sejtkultúrákban az egyes gének kifejeződésének mértékét az adott tenyészet GAPDH expressziójához

hasonlítottuk, így a gének expressziójának relatív értékét vethettük össze az egyes tenyésztési felszíneken. Csak azokat a géneket ábrázoltuk a 23. Ábrán, ahol szignifikáns különbségeket mértünk és a változás mértéke meghaladta a 2-szeres különbséget. A gipsz felszínen tenyésztett sejtek génexpressziós profilja eltért a tenyésztő plate-n tenyésztett preoszteoblasztok génexpressziójától. A II típusú kollagén (COL2A1) expressziója 130-szor magasabb volt (p<0,001) a gipszkorongon. A 51 fibronektin 1 (FN1), a SMAD3 és a SMAD6 szintén nagyobb mértékben expresszálódott a gipszen. A tenyésztő platen, standard Ca2+-szint mellett növekvő sejtekben 12-szeres növekedést mértünk az I. típusú kollagén (COL1A1) expressziójában. A dekorin (DCN) és a csont morfogenetikus protein-4 (BMP4) specifikus mRNS-ek szintjében csökkenést detektáltunk a gipszfelszínen. A csont szialoprotein (BSP), az oszteokalcin (BGLAP)

és a kalcium-szenzor (CASR) nem expresszálódott mérhető mértékben a gipszkorongokon. 14. Ábra Az alkalikus foszfatáz aktivitás (A) és a SMAD3 expresszió (B) 15 napos tenyészetekben (mean±SD, *: p<0,05, : p<0,01) A. ALP aktivitás a médiumban (U/g protein) ALP aktivitás a 15 napos sejttenyészetekben * 40 * * 35 30 25 20 15 10 5 0 TP A gén GAPDH-hoz viszonyított relatív expressziója B. TP25 GIPSZ PMMA SMAD3 expresszió 15 napos tenyészetekben * * * 0,008 0,007 0,006 0,005 0,004 0,003 0,002 0,001 0 TP TP25 GIPSZ PMMA 52 A standard tenyésztő médium Ca2+-szupplementációját követően, magas Ca2+koncentráció mellett, a COL2A1 expressziójának 80-szoros növekedését és a COL1A1 20-szoros csökkenését mértük a tenyésztő plateken nevelt sejtkultúrákban. A SMAD6 és a SMAD3 szintén szignifikánsan jobban expresszálódott a Ca2+-szupplementált tenyészetekben, a gipszkorongokhoz hasonlóan. A DCN, a BMP4 és a BSP

mRNSátíródása csökkent a magas Ca2+-szint mellett A standard, 1,8 mM Ca2+-t tartalmazó médiumban nevelt sejteknél a tenyésztő platen expresszálódott a CASR és a BGLAP, míg magas, 25,5 mM-os Ca2+-koncentrációnál a gének átíródása nem volt mérhető. A magas Ca2+-koncentrációjú médium mellett a tenyésztő plateken mérhető expressziós profil a gipszkorongon tenyésztett sejtekéhez volt hasonló. Az MC3T3-E1 sejtek COL2A1 expressziója jelentősen magasabb volt gipszen, mint a PMMA-korongokon (51-szeres különbség, p<0,001), míg a COL1A1 7-szer magasabb szinten expresszálódott a PMMA-n. Az FN1, a SMAD6 és a SMAD3 szintén a gipszen expresszálódott jobban, míg a BMP4 és a DCN a PMMA-n fejeződött ki nagyobb mértékben. A CASR, a BGLAP és a BSP expressziója nem volt mérhető gipszen, míg PMMA-n a gének szignifikáns expresszióját detektáltuk. A PMMA korongokon tenyésztett sejtek expressziós profilja a standard tenyésztő platen nevelt

sejtkultúrák génexpressziójához volt hasonló. 53 Relatív génexpresszió Relatív génexpresszió Relatív génexpresszió 0 1 2 3 4 0 0,001 0,002 0,003 0,004 0 0,1 0,2 0,3 0,4 CP TP TP CP CP TP * * * BSP TP25 CP25 CP25 TP25 * DCN GIPSZ GYPS † GYPS GIPSZ GYPS GIPSZ COL1A1 * CP25 TP25 * * * PMMA PMMA PMMA PMMA PMMA PMMA 0 0,00003 0,00006 0,00009 0,00012 0 0,0025 0,005 0,0075 0,01 0 0,06 0,12 0,18 0,24 TP CP CP TP CP TP * * TP25 CP25 † † GIPSZ GYPS† † GYPS GIPSZ GYPS GIPSZ BGLAP CP25 TP25 * BMP4 CP25 TP25 * COL2A1 * * PMMA PMMA PMMA PMMA PMMA PMMA Relatív génexpresszió Relatív génexpresszió Relatív génexpresszió Relatív génexpresszió Relatív génexpresszió Relatív génexpresszió 0 0,0000015 0,000003 0,0000045 0,000006 0 0,0025 0,005 0,0075 0,01 0 1,7 3,4 5,1 6,8 CP TP CP TP CP TP * * CP25 TP25 † CASR CP25 TP25 GYPS GIPSZ GYPS GIPSZ † GYPS

GIPSZ SMAD6 * FN1 * CP25 TP25 * * * PMMA PMMA PMMA PMMA PMMA PMMA 15. Ábra A génexpresszió relatív mértéke az egyes tenyésztő felületeken 15 napos tenyészetekben (mean±SD, *: p<0,05, : p<0,01) 54 6. Megbeszélés 6.1 Új kandidáns gének összefüggése a csontdenzitással és a törési rizikóval A csontritkulás kialakulásában a genetikai faktoroknak kiemelt szerepe van. A csúcscsonttömeg – a mérési helytől és a vizsgált populációtól függően – 60-80%-ban genetikailag determinált [9, 14-16] és a család- és ikervizsgálatok eredményei a törési rizikót befolyásoló egyéb csont-paraméterek – csontminőség, combnyak geometria [164], izomerő [165], csontturnover [166], BMI [167], menopauzális életkor [168] – genetikai meghatározottságát igazolták. Számos olyan monogénes eltérésről tudunk, amely ritka, csontrendszeri eltérésekkel járó öröklődő betegséghez vezet, de az oszteoporotikus

csontvesztés patogenezisének pontos genetikai hátterét nem ismerjük, az irodalmi közlemények pedig gyakran ellentmondásosak, melynek oka részben a metodikai eltérésekben és az etnikai különbségekben keresendő. A csonttörések rizikóját tekintve a genetikai faktorok erejét 25-50%-nak mérték a csuklótörések [169], [170] és 60-70%-nak a csípőtáji törések [171] kapcsán, azzal a fontos konklúzióval, hogy a 65 éves kor előtt bekövetkezett töréseknél ilyen magas a genetikai faktor hatása, amely hatás az életkor előrehaladtával gyengül. Az alacsony csontdenzitás fokozott törési rizikót jelent, de a két oszteoporotikus fenotípus (alacsony BMD és fokozott törési rizikó) részben eltérő genetikai háttérrel rendelkezhet [172]. Kutatásunkban öt új, potenciálisan kandidáns gén 24 polimorfizmusának összefüggését vizsgáltuk a posztmenopauzás csontritkulással. Az öt kiválasztott gén közül négy gén polimorfizmusainak

szerepét nem közölték korábban a nemzetközi irodalomban. Három olyan individuális SNP-t találtunk, amelyek szignifikáns összefüggést mutattak a csontritkulással. Az FGFR1 a tirozin-kináz receptor családba tartozó transzmembrán molekula, amely oszteoblasztokon és oszteoklasztokon is megtalálható és a mesenchymális őssejt oszteogén differenciálódásában játszik szerepet [173-175]. Az FGFR molekulacsalád jelentőségét mutatja, hogy másik tagja, az FGFR3 mutációja okozza a domináns öröklődésű achondropláziát. Az FGFR1 mutációit kapcsolatba hozták a szkeletális deformitásokkal járó Pfeiffer és Kallmann szindrómákkal, a fog-agenezissel [176] és a gén haplotípusait a koponya normál variációival találták összefüggőnek [177]. Korábbi vizsgálatunkban az FGFR1- 55 specifikus mRNS csökkent expresszióját találtuk oszteoporotikus csontszövetben. Jelen vizsgálatunkban az FGFR1 génben található rs6996321 polimorfizmus

szignifikánsan befolyásolta a lumbális BMD-t. Az 1 intronban található SNP egy tag-polimorfizmus, a gén első szakaszában (promóter, 1. exon, 1 intron) található SNP-kel r2>0,8 valószínűséggel van kapcsoltsági viszonyban. Valószínűleg az intronikus SNP így inkább genomikus markerként szerepelhet, mint a gén működését közvetlenül befolyásoló variáns. Az SNP erős kapcsoltságban van az rs2568231 SNP-vel, amely a gén egy splice site-jában helyezkedik el, 7 bp-nyira az 1. exontól és elképzelhető, hogy a poszttranszkripciós splicing mechanizmus befolyásolásán keresztül hatással lehet a gén funkcióra. A génben található 4 SNP-ből konstruált FGFR1 haplotípus önálló befolyással bírt a lumbális csontdenzitásra, alátámasztva a feltételezést, hogy az FGFR1 génnek szoros kapcsolata lehet a csont-metabolizmussal és variánsai befolyással bírnak a csontritkulás kialakulására. A FABP3 gén promóterében található rs10914367

SNP homozigóta recesszív genotípusa szignifkánsan korrelált a magasabb femur BMD-vel. Az SNP a gén promóter régióját, 1. exonját és 1 intronját taggeli és a szekvencia analízis során transzkripciós faktor (TF) kötő helyeket azonosítottunk a lókuszt tartalmazó génszakaszon. Az ’A’ allél esetén a következő négy TF képes a génszakaszhoz kötődni, több mint 90%-os homológiát feltételezve (az rs10914367 allél aláhúzásával); FOXP3 – forehead boksz protein P3 (GCCAAC), C/EBPbeta – CCAAT enhancer binding protein beta (CCAA), PR-A and PR-B – progeszteron receptor A és B izoforma (AACACCA). A ’G’ allél esetében ezek a TF kötő helyek „eltűnnek”, amely alapján feltételezhető, hogy a polimorfizmusnak transzkripció-regulátor szerepe lehet. A FABP3 a zsírsavmetabolizmusban játszik szerepet, a sejtek zsírsavfelvételét és a zsírsavak intracelluláris transzportját regulálja [178] és korábban összefüggésbe hozták a

diabetes mellitus és az elhízás patogenezisével [178, 179]. A molekula expresszálódik a csontvelő eredetű mesenchymális őssejteken [180], és a gén expresszióját a PPARγ is befolyásolja, amely transzkripciós faktor összefüggését leírták a csontvesztés folyamatával. A PPARγ a mesenchymális őssejtek adipogén differenciálódását serkenti, valamint gátolja az oszteogén fejlődési utat [29, 30]. Ezt a rendszert befolyásolja a közelmúlt oszteológiai kutatásainak másik kandidánsai, az ALOX12, ALOX15 molekulák [181, 182]. Fenti eredményeink alátámasztják a korábban feltételezett kapcsolatot a csont és a lipid 56 metabolizmus között [183-185], kihangsúlyozva, hogy a FABP3 és allelikus variánsainak pontos szerepének tisztázására további vizsgálatok szükségesek. Munkánkban azonosítottunk egy SNP-t a TIMP2 génben (rs9900972), amely a non-vertebrális törési rizikóval mutatott szignifikáns kapcsolatot. A polimorfizmus ’A’

allélét hordozókban 2-szeres törési rizikót mutattunk ki az ’A’ allélt nem hordozókhoz képest. Ez az SNP intronban helyezkedik el és a gén középső régiójával van magas genetikai kapcsoltsági viszonyban. Így a törési rizikó markereként és nem a génfunkciót direkt befolyásoló variánsként értelmezhetjük. A TIMP2 a – normális [186] és patológiás [187, 188] csontmetabolizmusban kiemelt szerepet játszó – mátrix metalloproteinázok (MMP) nem specifikus inhibítora. Az oszteoblasztok által termelt ECM mennyisége és minősége közvetlenül determinálja a csontszövet mennyiségi és minőségi jellemzőit és így a törésre való hajlamot. Az MMP kaszkádrendszer egyes tagjainak génpolimorfizmusait korábban már leírták a csontmetabolizmussal összefüggésben. Az MMP1 és az MMP9 allelikus variánsait szignifikánsan összefüggőnek találták a csontdenzitással [189, 190]. Az MMP2 polimorfizmusait a multiplex oszteolízis és

arthritis szindróma prediktoraként azonosították [188]. Az enzim fontos szerepét bizonyították malignus betegségek [191] és az egészséges csontgyógyulás [192] folyamatában. Vizsgálatunkban az MMP2 variánsait önmagukban nem találtuk szignifikánsan összefüggőnek a csontritkulás fenotípusaival, de találtunk olyan szignifikáns gén-gén interakciót, amelyben részt vett a gén. A TIMP2-vel olyan interakciót azonosítottunk, amely a törési rizikót befolyásolta a vizsgálati populációnkban. A TIMP2 allelikus variánsai befolyásolhatják az MMP-kra kifejtett gátló hatást, míg az MMP2 polimorfizmusai az enzim mátrixdegradáló aktivitását módosíthatják. A csökkent gátlás és/vagy a megnövekedett aktivitás felgyorsult ECM lebontáshoz vezet, amely a csont törékenységet fokozhatja. A TIMP2 szintén feltűnt az ALPL-lel alkotott szignifkáns, femur BMD-t befolyásoló gén-gén interakcióban. Az ALPL az oszteoid mátrix

mineralizációjának folyamatában nélkülözhetetlen enzim, szérumszintje korrelál a csont-turnover mértékével. Állat és humán vizsgálatok igazolták, hogy ALPL expresszió csökkent mértékű az alacsony csontmennyiséggel rendelkezőkben [118, 193]. A gén polimorfizmusait a hypophospatasia különböző formáival [194] és a csontdenzitással szintén összefüggésbe hozták [195]. Eredményeink alátámasztják a korábbi 57 feltételezéseket, miszerint az ALPL génpolimorfizmusai hatással vannak a posztmenopauzális oszteoporózis patogenezisére, de további vizsgálatokat látunk szükségesnek a fentiek tisztázására. Humángenetikai vizsgálatunkban külön figyelmet fordítottunk a polimorfizmusvizsgálatok kapcsán felmerülő statisztikai problémák kezelésére. Vizsgálatunk közepes nagyságú, jól dokumentált populáción végzett többszörös asszociációs vizsgálatnak minősült, ahol szigorú kritériumok mellett alkalmaztuk a

robosztus statisztikai próbákat a fals eredmények elkerülése érdekében. Az egyedi SNP analízis során 21 marker egyedi hatásait vizsgáltuk, négy fenotípuson, és permutációs próbát alkalmazva határoztuk meg a statisztikai próbákhoz tartozó empirikus p-értékeket. A szignifikiáns eredményeket csak azokban az eseteben diszkutáltuk, ahol a vizsgálat statisztikai ereje (power of the study) 80%-nál magasabb volt. A haplotípus vizsgálatok során a score tesztek esetében szintén empirikus p-értékeket nyertünk a permutációs próbák alkalmazásával, és a szignifikáns összefüggéseket egy másik statisztikai módszerrel – generalizált lineáris modellben – validáltuk. A gén-gén interakciókat abban az esetben fogadtuk el szignifikánsnak, ahol az LRT analízis során nyert magas szignifikancia szintet (p1<0,001) követően, regressziós analízisben is erősen szignifikáns (p2<0,01), validált interakciót találtunk. Minden vizsgálati

alanytól nagy mennyiségű klinikai és életmódi adatot gyűjtöttünk, adatbázisunkban így hatékonyan tudtuk érvényesíteni a kizárási és a korrekciós módszereket. 6.2 A kompressziós csigolyatörés minimál invazív kezelésében alkalmazott csontcementek hatása a nucleus pulposusra Hazánkban évi 35-40000 csigolyatest roppan össze az oszteoporózis következményeként és a kompressziós csigolyatörés elszenvedése után drámain nőnek a morbiditási és mortalitási kilátások, főleg kezeletlen eseteknél [5, 9, 10]. A kompressziós csigolyatörések minimál invazív sebészi terápiája az utóbbi évtizedben rutin eljárássá vált. Az összeroppant csigolyatest cement-augmentációját oszteoporotikus törések esetében is jó klinikai eredménnyel alkalmazhatjuk, azonban a 58 hosszútávú eredmények, és a különböző technikákat illetve a szövődményeket összehasonlító vizsgálatok irodalma közel sem teljes. In vitro

mérésekkel és számítógépes modellezéssel bizonyították, hogy a csigolyatest cement-augmentációja megnöveli a mozgásszegmentum szilárdsági és merevségi paramétereit [131, 196-200], valamint a beavatkozás megnöveli a szomszédos porckorongok nucleus pulposusában mérhető nyomást [196, 197, 200]. A megváltozott terhelési viszonyok a szegmentum posterior alkotórészein és a csigolyaközti porckorongon keresztül áttevődnek a szomszédos csigolyákra [196-198, 200] és a fenti biomechanikai változások a szomszédos csigolyák összeroppanásának rizikóját megnövelhetik, különösen a korai- és középtávú posztoperatív periódusban [196, 198, 200]. A csigolya-augmentációs eljárások kapcsán, az eljárást követő új csigolyatest törések bekövetkezése – leggyakrabban a kapcsolódó szegmentumokban – gyakori posztoperatív „szövődmény”, melynek pontos mechanizmusa és a új törés rizikóját befolyásoló faktorok még nem

ismertek [201-204]. A csigolya-augmentációk során a csigolyaközti porckorong állományába történő cement csorgás a leggyakoribb – általában tünetmentes – komplikáció. Kutatásunkban az alkalmazott csontcementek hatását vizsgáltuk izolált, humán nucleus pulposus sejteken, in vitro körülmények között. Az elterjedten alkalmazott PMMA csontcement – dózis és kezelési idő függvényében – szingifikánsan csökkentette az NP sejtek számát a tenyészetekben. A kezelési időt figyelembe véve, a PMMA esetében toxikus hatást mértünk, míg a HA gátolta a sejtek proliferációját, a gipsz pedig nem befolyásolta az NP sejtek életképeségét az alkalmazott dózisban. A fentiek alapján feltételezhető, hogy a különböző minőségű vertebroplasztikás csontcementek eltérő élettani hatással rendelkeznek (nem csak az NP sejtekre, hanem feltehetően a csigolyatest csontsejtjeire is). Az NP sejtek génexpressziós profilját szintén

szignifikánsan befolyásolták az alkalmazott vertebroplasztikás töltőanyagok. A csigolyaközti porckorong biomechanikai paramétereit alapvetően meghatározó major (COL1A1, AGC) és minor (BGN, DCN) extracelluláris mátrix (ECM) komponensek génexpressziója csökkent, a különböző csontcementek hatására eltérő mértékben. Szignifikáns változásokat mértünk a transzripciós faktorok (BMP2, SOX9) esetében is. A BMP2 expressziójának növekedése a HA és gipsz kezelt tenyészetekben valószínűleg az NP sejtek limitált 59 repair mechanizmusát jelzi [205-207], amit a PMMA-s kultúrákban nem tapasztaltunk. Az általunk mért sejtszám- és génexpressziós változások a csigolyaközti porckorong degenerációját kísérő hisztológiai és molekuláris jeleknek megfelelők [208]. Az ECM-t tekintve, a kollagén hálózat (dominánsan 2. típusú és 1 típusú kollagén) biztosítja a porckorong jó szakítószilárdságát, míg a

kollagén-hálózatot körbevevő proteoglikán (aggrekán, biglikán, dekorin) hidrogél felelős a discus rugalmasságáért, kompressziós rezisztenciájáért és viszkoelaszticitásáért [209]. CsSzabo és munkatársai korábban leírták, hogy a proteoglikánok termelése csökken a degenerált nucleus pulposusban [210] és a degeneráció mértéke korrelál a discus proteoglikán tartalmával [211]. Kísérletes terheléses vizsgálatokban, a terhelés növelésével párhuzamosan – a magas nyomástartományokat leszámítva – a kollagén termelés emelkedését mérték [206, 212]. Magas hidrosztatikai nyomás azonban az NP sejtek kollagén termelésének csökkenését eredményezi, és ezt találjuk in vivo, degenerált discusok esetében is [213, 214]. Más molekuláris komponensek – metalloproteázok (MMP) és inhibitoraik (TIMP), transzkripciós faktorok (SOX9 és BMP) – szintén módosítják a nucleus pulposus biomechanikai tulajdonságait és fontos szerepük

van a porckorong degeneráció folyamatában [205-208]. A megváltozott mátrix biológia megváltozott biomechanikai tulajdonságokat eredményez [215], a discus csökkent rugalmassága és szakítószilárdsága felelős – részben – az olyan degeneratív gerincbetegségek kialakulásáért, mint a gerincsérv vagy a spondylosis [209]. A porckorong állományába történő cementcsorgásról korábban leírták, hogy növeli a vertebroplasztikás eljárások után bekövetező új csigolyakompressziók rizikóját [216, 217]. A szövődmény bekövetkezése valószínűleg összefüggésben van a csigolyaközti porckorong megváltozott biomechanikai karakterisztikájával, illetve degenerációjának fokával [218]. Vizsgálatunkban kimutattuk, hogy a csigolyaplasztikás csontcementek – és főleg a klinikai gyakorlatban használatban lévő PMMA cement – csökkenti az NP sejtek proliferációját és az anabolikus mátrix proteinek génexpresszióját. Eredményeink

egybevágnak azokkal a korábbi vizsgálatokkal, amelyek a PMMA káros, toxikus hatását írták le csontsejteken [134, 137], valamint chondrocitákon [219]. Kutatásunk alapján feltételezhető, hogy a csigolyaközti porckorong állományába kerülő csontcement negatívan befolyásolja az NP szöveti integritását, amely gyorsult degenerációhoz, és így a porckorong biomechanikai 60 jellemzőinek hanyatlásához vezethet. A sokszor tapasztalt intradiscális cementcsorgás tehát közvetlen összefüggésben állhat a vertebroplasztikás eljárások után gyakran bekövetkező – korai, illetve középtávú posztoperatív szakban realizálódó – szomszédos csigolyák összeroppanásával. 6.3 A szintetikus csontpótló graftként felhasználható gipsz hatása preoszteoblaszt sejtekre A csontpótlás kérdéskörének jelentőségét mutatja, hogy világszerte, évente több mint 2 millió esetben kerül sor csontpótló beavatkozásra, és a növekvő

igények kielégítése érdekében intenzív fejlesztések folynak az ideális szintetikus csontpótló graft kifejlesztése érdekében. A kristályos kalcium-szulfát (gipsz) csonthiány-kitöltő anyagként való alkalmazásáról régóta jelennek meg klinikai beszámolók, de a szintetikus graft biológiai viselkedéséről nem sokat tudunk. A természetben fellelhető gipszkristály (CaSO4 * 2H2O) tökéletes kristályszerkezetű anyag, ellentétben a modellgipszből (CaSO4 * ½ H2O) „házilag” készített gipsszel, ahol sok kis apró gipszkristály növekszik egymás mellett, kialakítva egy térhálós makroszerkezetet. A gipsz vizes közegben gyengén disszociál Ca2+ és SO42- ionokra, vizsgálatunkban a sejttenyésztő médiumban így kialakuló Ca2+-koncentrációt 25,5 mM-nak mértük. A csont remodeling helyein (BMUk) az extracelluláris Ca2+-koncentráció akár 40 mM is lehet [220] és az emelkedett Ca2+szint az oszteoblasztok számára kemotaktikus és

proliferációs szignálként szerepel és serkenti a pre-oszteoblasztok differenciálódását [221-223]. Saját – a gipsznek a csontsejtekre gyakorolt hatásainak feltárását célzó – vizsgálatunkban azt találtuk, hogy az oszteoblasztok szignifikánsan magasabb rátával képesek osztódni a gipszfelületen, mint a PMMA csontcementen. Ezen felül, a gipsz fizikai szerkezete is fontosnak tűnik a csontsejtek megfelelő kitapadásában. A sejtek nem tudnak letapadni az ásványi gipszlapon, amelynek tökéletes kristályrács szerkezete nem „hozzáférhető” az oszteoblasztok számára. Abban az esetben azonban, ha a gipszkorongot modellgipszből (CaSO4-hemihidrát) készítjük víz hozzáadásával, az MC3T3-E1 sejtek jól megtapadnak a korong felszínén. A gipsz ezen formájában számos 61 apró kristály található egymás mellett, nagy molekuláris felszínt biztosítva a sejtek osztódásához és mátrix termeléséhez. Az ALP aktivitás az oszteoblaszt

tevékenység, a fokozott csont-turnover, csontremodeling markere. Emelkedett szérum-szintje mérhető a törés utáni csontgyógyulás során [224, 225]. A gipszfelszínhez tapadt csontsejtek ALP pozitívan festhetők [226] Winn és munkatársai [227] úgy találták, hogy a kalcium-szulfát pelleteken tenyésztett oszteoblasztok osztódási aránya és ALP aktivitása csökken, azonban ez erősen függ a tenyésztési körülményektől. Az ALP aktivitás és az MC3T3-E1 sejtek mineralizációs aktivitása az extracelluláris Ca2+-koncentráció befolyása alatt áll [221, 223], és valószínűleg összefügg a SMAD3 gén expressziójával (amely gén a TGFβ szignálútvonal kritikus komponense) [228]. Kutatásunkban azt találtuk, hogy megemelkedett ALP aktivitás mérhető azokban a tenyészetekben, ahol magas Ca2+-szint jellemezte a médiumot. A gipszen tenyésztett sejtekben és a platen nevelt, Ca2+szupplementált kultúrákban a SMAD3 expresszió szintén magasabb volt a

standard Ca2+-koncentrációjú és a PMMA-n tenyészettet sejtekkel összehasonlítva. Eredményeink abba az irányba mutatnak, hogy a magas extracelluláris Ca2+ ALP aktivitásra kifejtett stimuláló hatása – legalábbis részben – a csontképzésben és csontgyógyulásban ismert jelentőségű transzkripciós faktor [229], a SMAD3 expresszió serkentésén keresztül valósul meg. A magas SMAD3 expresszió eseteiben, az oszteogén differenciáció késői markereinek (BGLAP, BSP) transzkripciója csökkent volt, vagy nem volt mérhető. Ezek a mérések alátámasztják Sowa és mtsai [228] eredményét, akik azt találták, hogy a SMAD3 serkenti az ALP aktivitást és a mineralizációt, de gátolja az oszteokalcin expressziót az MC3T3-E1 sejtekben. Szintén leírták, hogy a TGFβ kezelés, vagy a SMAD3 transzfekció befolyásolja a sejtek alakját [230]. Ahogyan jelen kutatásban magunk is találtuk; a magas SMAD3 expresszióval jellemezhető sejtek inkább orsó

alakúak. Az in vitro nyert eredményeink azt mutatják, hogy az MC3T3-E1 preoszteoblaszt sejtek eltérő irányban differenciálódnak a vizsgálatainkban alkalmazott kísérleti körülmények között. Az extracelluláris mátrix összetevők génexpressziója markánsan változott az adott tenyésztő felülettől függően. A gipszkorongon nyert expressziós profil jellege a csontgyógyulás folyamatának irányába mutat. A különböző 62 kollagének és más kis mátrix molekulák expressziójában mért változások valószínűleg a magas extracelluláris Ca2+-szint következményei, mivel nagyrészt ezeket a változásokat detektáltuk a sejttenyésztő platen, magas Ca2+-tartalmú médiumban nevelt kultúrák esetében is. Korábbi tanulmányok leírták, hogy a csontgyógyulás folyamata során a COL2A1 és az FN1 megnövekedett expressziója mérhető a gyógyuló defektus területén [231, 232], és az újonnan képződő csont jól karakterizálható az aktív

oszteoblasztokban – és nem a chondrocitákban – szintetizálódó COL2A1 megjelenésével [233]. Az FN1 a törött csont hegmentes gyógyulásában játszhat szerepet [232]. A DCN – mint más proteoglikán a csontban – a kollagén-hálózat „összeszerelésében” és funkciójának kiegészítésében is fontos [31]. A gipszen mért génexpressziós mintázat a fentiekhez hasonlónak bizonyult kísérleteinkben. 63 7. Következtetések Az oszteoporózist jellemző fenotípusokat (csökkent csontsűrűség, emelkedett törési rizikó) befolyásoló genetikai faktorok és a genetikai tényezők egymással való kapcsolata teljes egészében nem ismert. Az egyes gének, génváltozatok egyedi hatása csekélynek bizonyult a korábbi vizsgálatokban (pl. a csontdenzitásra még a legszignifikánsabb polimorfizmusoknak is önmagukban 0,5-2%-os befolyásoló hatásuk van [17-20, 92]). A multifaktoriális kórkép hátterében poligénes öröklésmenet és az egyes gének

egymással való interakciója valószínűsíthető. A multigénes modell alátámasztása érdekében végeztünk – egy hangsúlyozottan demonstratív célú – analízist a következő metodika szerint. A lumbális BMD esetében a korábban diszkutált rs6996321 FGFR1 SNP mellett, találtunk két másik SNP-t, amelyek szignifikáns befolyással bírtak a csontdenzitásra. Munkánkban szigorú kritériumokat alkalmaztunk az individuális SNP-analízisek eredményeire vonatkozólag. A két másik (rs3738099 – ALPL, és rs10914367 – FABP3) SNP-vel talált összefüggés nem teljesítette a study power-re vonatkozó kritériumunkat (power > 80%). A továbbiakban kiszámítottuk, hogy a lumbális denzitást befolyásoló 3 új polimorfizmus a teljes populációs varianciára milyen mértékű hatással bír. Ehhez a számításhoz generalizált lineáris modell-be (GLM) illesztettük az adott modellnek (additív, domináns, recesszív) megfelelően kódolt SNP-ket és függő

változóként az adjusztált lumbális BMD-t. A statisztikai számítás eredményében, ez alkalommal a megmagyarázott hányadot jellemző R2 illetve adjusztált R2 értékeket elemeztük. Az SNP-k egyedi beillesztésénél a következő adjusztált R2 értékeket kaptuk; 0,03 (rs6996321), 0,005 (rs3738099) és 0,005 (rs10914367), ami az SNP-k 3%, 0,5% és 0,5%-os egyedi hatását jelenti a lumbális gerinc csontdenzitás varianciájára vonatkoztatva. Kiemelendő, hogy az individuális analízis során alkalmazott szigorú „rostánkon” fennmaradt rs6996321 FGFR1 polimorfizmus egyedi hatása kiemelkedően magas, ami aláhúzza az újonnan leírt polimorfizmus jelentőségét. A következő lépésben a modellbe mindhárom SNP-t beillesztettük. Így a teljes modell adjusztált R2 értéke 0,048-nak, azaz majdnem 5%-nak adódott, jelezve a egyrészt multigénes modell, és a multiplex genetikai analízis létjogosultságát, másrészt az egyes genomikai faktorok hatásának

non-additív jellegét. A végső lépésben a modellünkbe beillesztettük a lumbális csontdenzitásra 64 szignifikánsnak talált gén-gén interakciót, amelyet az rs10914367 (FABP3) és az rs1030868 (MMP2) között írtunk le. A gén-gén interakció egyedi hatását 1,8%-nak mértük (adjusztált R2=0,18), azonban a három SNP mellé illesztve a teljes megmagyarázott hányadot „csak” további, mintegy 0,5%-kal emelte (ebben az esetben a teljes modell adjusztált R2 0,053 volt). A csontdenzitás multiplex genetikai hátterének vizsgálata és értelmezése során tehát figyelembe kell venni azt a tényt, hogy az egyedi SNP-k hatása és a gén-gén interakciók hatása nem egyszerűen összeadódik, szummálódik, ezért a jövőbeni vizsgálatok során törekedni kell, hogy egyidőben minél több kandidáns génpolimorfizmust vizsgáljunk, a valóságos biológiai konstelláció minél tökéletesebb leírására. Vizsgálatunkban nem találtunk olyan egyedi

génpolimorfizmust, vagy SNP-SNP interakciót, amely mind a csontdenzitást, mind a törési rizikót szignifikánsan befolyásolta volna, bár két gén is (TIMP2 és MMP2) szerepelt mind a csontdenzitást és mind a törési rizikót befolyásoló gén-gén interakciókban. Eredményeink alátámasztják azokat az elméleteket, miszerint a csontmetabolizmus változását számos eltérő genetikai mintázat eredményezheti. A különböző gén-gén interakciók, SNP-kombinációk eredőjeként hasonló fenotípus jöhet létre. Ilyen értelemben a csontritkulás genetikai háttere diverz – a hasonló fenotípusos megjelenés ellenére. A csontdenzitást és a törési rizikót negatívan és pozitívan befolyásoló környezeti faktorok mellett a genetikai háttérben is az adott egyénben érvényesülő károsító és protektív genetikai faktorok eredője befolyásolja érdemben a betegség manifesztációját. A komplex genetikai háttér megértéséhez, és így a betegség

patogenezisének megértéséhez, azaz a diagnosztika és a kezelés fejlesztéséhez tehát olyan típusú vizsgálatokra van szükség, amelyet munkánkban is demonstráltunk. Minél nagyobb esetszámú populáción, több gén / génpolimorfizmus egyidejű analízise segíthet feltárni azokat a molekuláris szinten érvényesülő génvariánsokat és gén-interakciókat, amelyek a tényleges genetikai háttér elemeit jelentik. Kutatómunkánk során öt gén – ALPL, FABP3, FGFR1, MMP2, TIMP2 – polimorfizmusainak összefüggését bizonyítottuk a humán oszteoporózissal. A négy utóbbi gén szerepét eddig nem vizsgálták a csontritkulás kapcsán. Az öt gén új kandidánsként szerepelhet a további humán vizsgálatokban, mivel az ortológ-modell, a szarvas-agancsképzés kapcsán kerültek először látóterünkbe, génexpressziós 65 változásaikat humán csontszövetben írtuk le korábban, jelen munkánkban pedig egyes génvariánsaikat a betegséggel

összefüggőnek találtuk. A csontritkulás kapcsán azonban a szövődmények, csonttörések kezelése jelenti az egyik legnagyobb egészségügyi és gazdasági problémát a modern társadalmakban. A csigolyatörések okozta morbiditás redukciójában jelentős előrelépést jelentett a perkután csigolya-augmentációs eljárások kifejlesztése, amely sebészi terápiák közel 20 éve állnak rendelkezésre a modern gerincsebészeti centrumokban a kompressziós csigolyatörést elszenvedett betegek kezelésére. A minimál invazív eljárások szövődményeiről, illetve a felhasznált szintetikus csontpótló graftok biológiai viselkedéséről kevés adat áll rendelkezésünkre. A vertebroplasztikás eljárások biomechanikai következményei nagyban függnek az alkalmazott töltőanyag minőségi jellemzőitől [131, 132, 139, 218]. Saját vizsgálatunkban az egyes csontcementek biológiai hatásaiban is jelentős különbségeket tapasztaltunk. A mindennapi klinikai

gyakorlatban használt PMMA csontcement negatívan befolyásolta a nucleus pulposus sejtek életképességét és génexpresszióját. Figyelembe véve, hogy a porckorongba került csontcement degeneratív folyamatokat indukálhat a szegmentum rugalmasságáért leginkább felelős alkotóelemben, a nucleus pulposusban, eredményeink alapján valószínűsíthető, hogy ez a gyakran tapasztalt szövődménytípus hozzájárulhat a csigolya-augmentációkat követő új kompressziós törések bekövetkezéséhez. A fentiekre alapozva kijelenthető, hogy a csigolya-augmentációs eljárások szövődmény rátájának csökkentése érdekében, biomechanikailag és biológiailag optimális – az NP sejtek életképességét és génexpresszióját kevésbé befolyásoló – töltőanyag alkalmazása volna szükséges. Mindeddig az intenzív kutatások ellenére sem sikerült az optimális csontpótló graftot kifejleszteni. A szintetikus graft-típusok elterjedésével nagyobb szerep

juthat a gipszként ismert kalcium-szulfát-dihidrátnak is. Számos szerző úgy írta le a gipszet, mint biztonságos, felszívódó, csonthiány kitöltő anyagot [234, 235]; melynek lassú abszorpciója lehetőséget teremt a fibrovaszkuláris szövet benövésére és az érújdonképződésre [236], majd újcsont képződésre a defektusban [237]. Walsh és munkatársai [238] feltételezték először a kalcium-szulfát oszteoinduktív hatását, amit a 66 kalcium-szulfát pelletekkel kitöltött csonthiányban kimutatható magas TGFβ-szinttel támasztottak alá. Ezt a hatást a pelletek oldódása miatt kialakuló lokálisan savas kémhatással kapcsolták össze. A klinikumban megfigyelt előnyös tulajdonságait molekuláris biológiai eszközökkel vizsgálva azt találtuk, hogy a gipszen a csontsejtek jobban osztódnak, és nagyobb arányban expresszálják az újcsont képzésben fontos szerepet játszó géneket a – csonthiány kitöltésre elterjedten alkalmazott

– PMMA-n tenyésztett sejtekkel összehasonlítva. A gipsz hatékonyabb környezetet biztosít a csont gyógyulás folyamatának. Eredményeink alátámasztják a korábbi feltételezést, miszerint a gipsz nem egyszerűen egy „passzív” oszteokonduktív anyag, hanem speciális kristályszerkezetének és magas kalcium-tartalmának köszönhetően oszteoinduktív potenciállal bír. A szintetikus graftok alkalmazásának egyéb kérdéseire – applikáció, biomechanika – adott sikeres válaszok esetén, a gipsz egy jó ár/érték aránnyal bíró, biológiailag optimális csontpótló graftként szerepelhet a mindennapi klinikai gyakorlatban. Összegezve, kutatómunkánk során az alábbi összefüggéseket tártuk fel, amelyekre korábbi adatot nem találtunk a nemzetközi szakirodalomban: 1. A szarvasmodellben azonosított – új – kandidáns géneket tanulmányozva, szignifikáns kapcsolatot találtunk az FGFR1 gén allelikus variánsa (rs6996321) és a lumbális

csontdenzitás, illetve a FABP3 egyik SNP-je (rs10914367) és a femur BMD között. 2. Vizsgálatunkban találtunk egy olyan polimorfizmust a TIMP2 génben (rs9900972), amely a non-vertebrális törési rizikót szignifikánsan befolyásolta. 3. A haplotípus elemzések során kimutattuk, hogy az FGFR1 négy SNP-ből konstruált haplotípusa szignifikánsan befolyásolja a lumbális csontdenzitást. 4. Először írtunk le olyan gén-gén interakciókat az öt új kandidáns gén polimorfizmusai között, amelyek szignifikánsan befolyásolták a csontdenzitást illetve a non-vertebrális törési rizikót. 5. Kutatómunkánkban igazoltuk, hogy a különböző anyagi minőségű vertebroplasztikás töltőanyagok eltérő mértékben befolyásolják a nucleus pulposus 67 sejtek életképességét és osztódását, kiemelve, hogy a mindennapi klinikai gyakorlatban használt PMMA csontcement toxikus hatásával ellentétben a gipsz-alapú csontcement előnyösebbnek

bizonyult méréseinkben. 6. A vertebroplasztikás csontcementek az izolált nucleus pulposus sejtek génexpressziós profilját is befolyásolták. Molekuláris biológiai eszközökkel végzett vizsgálataink vezettek ahhoz a klinikai szempontból jelentős megállapításhoz, miszerint a csigolya-augmentációs eljárást követő új kompressziós törések bekövetkeztének rizikóját fokozhatja az intervertebrális diszkuszba kerülő csontcement. 7. Megállapítottuk továbbá, hogy a gipsz alapú csontpótló grafton az egér preoszteoblaszt sejtek képesek megtapadni, osztódni és mátrixot termelni. 8. Először írtuk le, hogy a gipszen tenyésztett oszteoblasztok differenciálódása a csontgyógyulás irányába mutat, ami molekuláris biológiai bizonyítékot szolgáltat a gipsz alapú szintetikus csontpótló graftok klinikai alkalmazásának indikációjához. Az előnyös biológiai változások kapcsolatban vannak a gipsz speciális kristályszerkezetével és

magas felületi Ca2+- koncentrációjával. 68 8. Össszefoglalás Az oszteoporózis népbetegség, melynek kialakulásában az életmódi faktorok mellett örökletes, genetikai tényezők is szerepet játszanak. Régóta bizonyított tény, hogy a csúcscsonttömeg 60-80%-ban genetikailag determinált de a folyamatra ható gének pontos szerepét – az 1980-as évektől folyó intenzív kutatások ellenére – még nem ismerjük. Kutatómunkánk során megvizsgáltuk, hogy egy ortológ (gímszarvas) modellben korábban azonosított öt új kandidáns gén – az alkalikus foszfatáz (ALPL), a zsírsav kötő protein-3 (FABP3), a fibroblaszt növekedési faktor receptor-1 (FGFR1), a mátrix metalloproteináz-2 (MMP2), és a metalloproteináz szöveti inhibítor-2 (TIMP2) – allelikus variánsainak van-e hatása a csontdenzitásra és a törési rizikóra. Vizsgálatuk továbbá, hogy a csontritkulás leggyakoribb törési szövődményének – a kompressziós

csigolyatöréseknek – minimál invazív kezelésekor gyakran észlelt szövődmény, az intradiszkális cementcsorgás, milyen következményekkel járhat a porckorong biológiájára nézve. Kutatómunkánkban a gipsz szintetikus csontpótló graftként történő alkalmazásának molekuláris biológiai oldalát is körbejártuk. Háromszázhatvan posztmenopauzás nőt vontunk be genomikai vizsgálatunkba és az öt új kandidáns gén 24 egypontos nukleotid polimorfizmusának (SNP) hatását vizsgálatuk a BMD-re és a törési rizikóra. Robosztus statisztikai módszereket alkalmazva haplotípuselemzéseket és gén-gén interakciós analíziseket is végeztünk. Az in vitro vizsgálatokhoz izolált humán nucleus pulposus sejteket és egér preoszteoblaszt kultúrákat használtunk, amelyeket a különböző szintetikus csontpótló anyagokkal kezelve mértük a sejtek életképességét és génexpressziós profilját. Az új kandidáns génben vizsgált egyedi SNP-k közül

az FGFR1-ben található rs6996321 szignifikánsan befolyásolta a lumbális BMD-t, a FABP3 promóter régiójában fekvő rs10914367 polimorfizmus a femur csontdenzitással volt összefüggésben, míg a az rs9900912 TIMP2 polimorfizmus a non-vertebrális törési rizikót befolyásolta vizsgálatunkban. Szignifikáns összefüggést találtunk az FGFR1 haplotípusa és a lumbális csontdenzitás között, és négy, a fenotípusokat befolyásoló gén-gén interakciót azonosítottunk mintánkban. Leírtuk, hogy a porckorongsejtekre a mindennapi gyakorlatban használt polimetil-metakrilát csontcement káros sejtélettani hatással bír, míg a kísérleti stádiumban lévő hidroxi-apatit és gipsz alapú cementek 69 biológiailag megfelelőbbnek bizonyultak. A gipsz előnyösen befolyásolta vizsgálatunkban a csontsejtek osztódási és differenciálódási jellemzőit, míg a polimetilmetakrilát toxikusnak bizonyult a csontsejtekre nézve. Kutatómunkánk

során új, a csontritkulás folyamatában szignifikáns jelentőséggel bíró kandidáns géneket illetve polimorfizmusokat azonosítottunk. Kimutattuk továbbá, hogy a csigolya-augmentációs eljárások során gyakran előforduló intradiszkális cementcsorgás növelheti a beavatkozás után előforduló új csigolyakompressziók kockázatát, ezért a cementcsorgás elkerülését célzó műtéti technikák, illetve biológiailag előnyösebb cementek kifejlesztése és alkalmazása volna szükséges. Bebizonyítottuk, hogy a gipsz csontpótló graftként való alkalmazása élettani szempontból megalapozott, mivel a gipsz esetén a csontsejtek az újcsontképződés irányába differenciálódnak, ami valószínűleg a gipsz magas kalciumtartalmával és speciális kristályszerkezetével magyarázható. 70 9. Irodalomjegyzék 1. Dennison E, Cole Z, Cooper C (2005) Diagnosis and epidemiology of osteoporosis. Curr Opin Rheumatol 17: 456-461 2. Dennison E,

Mohamed MA, Cooper C (2006) Epidemiology of osteoporosis. Rheum Dis Clin North Am 32: 617-629. 3. Lane NE (2006) Epidemiology, etiology, and diagnosis of osteoporosis. Am J Obstet Gynecol 194: S3-11. 4. Lau EM (2001) Epidemiology of osteoporosis. Best Pract Res Clin Rheumatol 15: 335-344. 5. Poor G, Kiss C, Szilagyi M, Mituszova M, ONeill TW, Felsenberg D, Silman AJ (1997) [Prevalence of vertebral deformity in Hungary: the European Vertebral Osteoporosis Study]. Orv Hetil 138: 2647-2652 6. Szepesi A, Salamon A, Kazar G (1991) [Incidence of fractures of the proximal femur and the distal end of the forearm (results of a Vas County survey compared to international data)]. Magy Traumatol Orthop Helyreallito Seb 34: 201-207. 7. Somogyi P, Bossányi A, Kricsfalusy M, Schreiterhofer L, Rápolthy I, Udvardy Cs, Horváth Cs (2000) Az osteoporosis eredetű csonttörések számának becslése Magyarországon. Ca és Csont 3: 111-117 8. Somogyi P (2006) Az osteoporosis

epidemiológiája. In: Lakatos P, Takács I (szerk.) Metabolikus csontbetegségek Medintel Könyvkiadó, Budapest, 2006: 147-153. 9. Kado DM, Browner WS, Palermo L, Nevitt MC, Genant HK, Cummings SR (1999) Vertebral fractures and mortality in older women: a prospective study. Study of Osteoporotic Fractures Research Group. Arch Intern Med 159: 12151220 10. Johnell O, Kanis JA, Oden A, Sernbo I, Redlund-Johnell I, Petterson C, De Laet C, Jonsson B (2004) Mortality after osteoporotic fractures. Osteoporos Int 15: 38-42. 71 11. Kazar G, Cserhati P, Melly A, Manninger J, Kadas I (1997) [Five-year follow up of patients with femoral neck fractures]. Orv Hetil 138: 3173-3177 12. Kanis JA, Borgstrom F, De Laet C, Johansson H, Johnell O, Jonsson B, Oden A, Zethraeus N, Pfleger B, Khaltaev N (2005) Assessment of fracture risk. Osteoporos Int 16: 581-589. 13. National Osteoporosis Fundation (1998) Analysis of the effectiveness and cost of screening and treatment strategies for

osteoporosis: a basis for development of practice guidelines. Osteoporos Int 8: 1-88 14. Sigurdsson G, Halldorsson BV, Styrkarsdottir U, Kristjansson K, Stefansson K (2008) Impact of genetics on low bone mass in adults. J Bone Miner Res 23: 1584-1590. 15. Tse KY, Macias BR, Meyer RS, Hargens AR (2009) Heritability of bone density: regional and gender differences in monozygotic twins. J Orthop Res 27: 150-154. 16. Videman T, Levalahti E, Battie MC, Simonen R, Vanninen E, Kaprio J (2007) Heritability of BMD of femoral neck and lumbar spine: a multivariate twin study of Finnish men. J Bone Miner Res 22: 1455-1462 17. Deng HW, Mahaney MC, Williams JT, Li J, Conway T, Davies KM, Li JL, Deng H, Recker RR (2002) Relevance of the genes for bone mass variation to susceptibility to osteoporotic fractures and its implications to gene search for complex human diseases. Genet Epidemiol 22: 12 18. Styrkarsdottir U, Halldorsson BV, Gretarsdottir S, Gudbjartsson DF, Walters GB, Ingvarsson T,

Jonsdottir T, Saemundsdottir J, Center JR, Nguyen TV, Bagger Y, Gulcher JR, Eisman JA, Christiansen C, Sigurdsson G, Kong A, Thorsteinsdottir U, Stefansson K (2008) Multiple genetic loci for bone mineral density and fractures. N Engl J Med 358: 2355-2365 19. Huang QY, Recker RR, Deng HW (2003) Searching for osteoporosis genes in the post-genome era: progress and challenges. Osteoporos Int 14: 701 20. Liu YJ, Shen H, Xiao P, Xiong DH, Li LH, Recker RR, Deng HW (2006) Molecular genetic studies of gene identification for osteoporosis: a 2004 update. J Bone MinerRes 21: 1511. 72 21. Favus MJ Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism American Society for bone and Mineral Research, Washington, 2006. 22. Eriksen EF (1986) Normal and pathological remodeling of human trabecular bone: three dimensional reconstruction of the remodeling sequence in normals and in metabolic bone disease. Endocr Rev 7: 379-408 23. Caetano-Lopes J, Canhao H, Fonseca JE

(2007) Osteoblasts and bone formation. Acta Reumatol Port 32: 103-110. 24. Canalis E, Economides AN, Gazzerro E (2003) Bone morphogenetic proteins, their antagonists, and the skeleton. Endocr Rev 24: 218-235 25. Zamurovic N, Cappellen D, Rohner D, Susa M (2004) Coordinated activation of notch, Wnt, and transforming growth factor-beta signaling pathways in bone morphogenic protein 2-induced osteogenesis. Notch target gene Hey1 inhibits mineralization and Runx2 transcriptional activity. J Biol Chem 279: 3770437715 26. Zou L, Zou X, Li H, Mygind T, Zeng Y, Lu N, Bunger C (2006) Molecular mechanism of osteochondroprogenitor fate determination during bone formation. Advances Adv Exp Med Biol 585: 431-441 27. Day TF, Yang Y (2008) Wnt and hedgehog signaling pathways in bone development. J Bone Joint Surg 90 Suppl 1: 19-24 28. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak DR (1999) Multilineage potential of adult human

mesenchymal stem cells. Science 284: 143-147 29. Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, Schwartz RE, Keene CD, OrtizGonzalez XR, Reyes M, Lenvik T, Lund T, Blackstad M, Du J, Aldrich S, Lisberg A, Low WC, Largaespada DA, Verfaillie CM (2002) Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 418: 41-49 30. Moerman EJ, Teng K, Lipschitz DA, Lecka-Czernik B (2004) Aging activates adipogenic and suppresses osteogenic programs in mesenchymal marrow stroma/stem cells: the role of PPAR-gamma2 transcription factor and TGFbeta/BMP signaling pathways. Aging Cell 3: 379 73 31. Corsi A, Xu T, Chen XD, Boyde A, Liang J, Mankani M, Sommer B, Iozzo RV, Eichstetter I, Robey PG, Bianco P, Young MF (2002) Phenotypic effects of biglycan deficiency are linked to collagen fibril abnormalities, are synergized by decorin deficiency, and mimic Ehlers-Danlos-like changes in bone and other connective tissues. J Bone Miner Res 17: 1180 32. Young MF, Bi Y, Ameye L, Chen XD (2002)

Biglycan knockout mice: new models for musculoskeletal diseases. Glycoconj J 19: 257-262 33. Mochida Y, Parisuthiman D, Pornprasertsuk-Damrongsri S, Atsawasuwan P, Sricholpech M, Boskey AL, Yamauchi M (2009) Decorin modulates collagen matrix assembly and mineralization. Matrix Biol 28: 44-52 34. Yamada T, Kamiya N, Harada D, Takagi M (1999) Effects of transforming growth factor-beta1 on the gene expression of decorin, biglycan, and alkaline phosphatase in osteoblast precursor cells and more differentiated osteoblast cells. Histochemical J 31: 687-694 35. Takeuchi Y, Kodama Y, Matsumoto T (1994) Bone matrix decorin binds transforming growth factor-beta and enhances its bioactivity. J Biol Chem 269: 32634-32638. 36. Sommer B, Bickel M, Hofstetter W, Wetterwald A (1996) Expression of matrix proteins during the development of mineralized tissues. Bone 19: 371-380 37. Kelm RJ, Jr., Swords NA, Orfeo T, Mann KG (1994) Osteonectin in matrix remodeling. A

plasminogen-osteonectin-collagen complex J Biol Chem 269: 30147-30153. 38. Heinegard D, Andersson G, Reinholt FP (1995) Roles of osteopontin in bone remodeling. Ann N Y Acad Sci 760: 213-222 39. Sivakumar P, Czirok A, Rongish BJ, Divakara VP, Wang YP, Dallas SL (2006) New insights into extracellular matrix assembly and reorganization from dynamic imaging of extracellular matrix proteins in living osteoblasts. J Cell Sci 119: 1350-1360. 40. de Oliveira PT, Zalzal SF, Irie K, Nanci A (2003) Early expression of bone matrix proteins in osteogenic cell cultures. J Histochem Cytochem 51: 633-641 74 41. Rammelt S, Neumann M, Hanisch U, Reinstorf A, Pompe W, Zwipp H, Biewener A (2005) Osteocalcin enhances bone remodeling around hydroxyapatite/collagen composites. J Biomed Mater Res A 73: 284-294 42. Chenu C, Colucci S, Grano M, Zigrino P, Barattolo R, Zambonin G, Baldini N, Vergnaud P, Delmas PD, Zallone AZ (1994) Osteocalcin induces chemotaxis, secretion of matrix

proteins, and calcium-mediated intracellular signaling in human osteoclast-like cells. J Cell Biol 127: 1149-1158 43. Hadjidakis DJ, Androulakis, II (2006) Bone remodeling. Ann N Y Acad Sci 1092: 385-396. 44. Bonewald LF (2002) Osteocytes: a proposed multifunctional bone cell. J Musculoskelet Neuronal Interact 2: 239-241. 45. Bonewald LF (2007) Osteocytes as dynamic multifunctional cells. Ann N Y Acad Sci 1116: 281-290. 46. Ehrlich PJ, Lanyon LE (2002) Mechanical strain and bone cell function: a review. Osteoporos Int 13: 688-700 47. Nomura S, Takano-Yamamoto T (2000) Molecular events caused by mechanical stress in bone. Matrix Biol 19: 91-96 48. Pitsillides AA, Rawlinson SC, Suswillo RF, Bourrin S, Zaman G, Lanyon LE (1995) Mechanical strain-induced NO production by bone cells: a possible role in adaptive bone (re)modeling? Faseb J 9: 1614-1622. 49. Boyle WJ, Simonet WS, Lacey DL (2003) Osteoclast differentiation and activation. Nature 423: 337-342 50. Dougall WC,

Glaccum M, Charrier K, Rohrbach K, Brasel K, De Smedt T, Daro E, Smith J, Tometsko ME, Maliszewski CR, Armstrong A, Shen V, Bain S, Cosman D, Anderson D, Morrissey PJ, Peschon JJ, Schuh J (1999) RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes Dev 13: 24122424 51. Grigoriadis AE, Wang ZQ, Cecchini MG, Hofstetter W, Felix R, Fleisch HA, Wagner EF (1994) c-Fos: a key regulator of osteoclast-macrophage lineage determination and bone remodeling. Science 266: 443-448 52. Yamashita T, Yao Z, Li F, Zhang Q, Badell IR, Schwarz EM, Takeshita S, Wagner EF, Noda M, Matsuo K, Xing L, Boyce BF (2007) NF-kappaB p50 and 75 p52 regulate receptor activator of NF-kappaB ligand (RANKL) and tumor necrosis factor-induced osteoclast precursor differentiation by activating c-Fos and NFATc1. J Biol Chem 282: 18245-18253 53. Bord S, Horner A, Hembry RM, Reynolds JJ, Compston JE (1996) Production of collagenase by human osteoblasts and osteoclasts in vivo. Bone 19: 35-40 54. Sims

NA, Gooi JH (2008) Bone remodeling: Multiple cellular interactions required for coupling of bone formation and resorption. 19: 444-451 55. Matsuo K, Irie N (2008) Osteoclast-osteoblast communication. Arch Biochem Biophys 473: 201-209. 56. Stains JP, Civitelli R (2005) Cell-to-cell interactions in bone. Biochem Biophys Res Commun 328: 721-727. 57. Rauner M, Sipos W, Pietschmann P (2007) Osteoimmunology. Int Arch Allergy Immunol 143: 31-48. 58. Lorenzo J, Horowitz M, Choi Y (2008) Osteoimmunology: interactions of the bone and immune system. Endocr Rev 29: 403-440 59. Yasuda H, Shima N, Nakagawa N, Yamaguchi K, Kinosaki M, Mochizuki S, Tomoyasu A, Yano K, Goto M, Murakami A, Tsuda E, Morinaga T, Higashio K, Udagawa N, Takahashi N, Suda T (1998) Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 3597-3602 60. Yasuda H, Shima N, Nakagawa N, Yamaguchi K, Kinosaki M,

Goto M, Mochizuki SI, Tsuda E, Morinaga T, Udagawa N, Takahashi N, Suda T, Higashio K (1999) A novel molecular mechanism modulating osteoclast differentiation and function. Bone 25: 109-113 61. Nakagawa N, Kinosaki M, Yamaguchi K, Shima N, Yasuda H, Yano K, Morinaga T, Higashio K (1998) RANK is the essential signaling receptor for osteoclast differentiation factor in osteoclastogenesis. Biochem Biophys Res Commun 253: 395-400. 62. Simonet WS, Lacey DL, Dunstan CR, Kelley M, Chang MS, Luthy R, Nguyen HQ, Wooden S, Bennett L, Boone T, Shimamoto G, DeRose M, Elliott R, Colombero A, Tan HL, Trail G, Sullivan J, Davy E, Bucay N, Renshaw-Gegg L, Hughes TM, Hill D, Pattison W, Campbell P, Sander S, Van G, Tarpley J, Derby 76 P, Lee R, Boyle WJ (1997) Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone density. Cell 89: 309-319 63. Burgess TL, Qian Y, Kaufman S, Ring BD, Van G, Capparelli C, Kelley M, Hsu H, Boyle WJ, Dunstan CR, Hu S, Lacey DL (1999) The

ligand for osteoprotegerin (OPGL) directly activates mature osteoclasts. J Cell Biol 145: 527-538. 64. Hofbauer LC, Khosla S, Dunstan CR, Lacey DL, Boyle WJ, Riggs BL (2000) The roles of osteoprotegerin and osteoprotegerin ligand in the paracrine regulation of bone resorption. J Bone Miner Res 15: 2-12 65. Aubin JE, Bonnelye E (2000) Osteoprotegerin and its ligand: a new paradigm for regulation of osteoclastogenesis and bone resorption. Osteoporos Int 11: 905913 66. Grimaud E, Soubigou L, Couillaud S, Coipeau P, Moreau A, Passuti N, Gouin F, Redini F, Heymann D (2003) Receptor activator of nuclear factor kappaB ligand (RANKL)/osteoprotegerin (OPG) ratio is increased in severe osteolysis. Am J Pathol 163: 2021-2031. 67. Martin TJ, Romas E, Gillespie MT (1998) Interleukins in the control of osteoclast differentiation. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 8: 107-123 68. Manolagas SC (1995) Role of cytokines in bone resorption. Bone 17: 63S-67S 69. Rozen N, Ish-Shalom S, Rachmiel A,

Stein H, Lewinson D (2000) Interleukin-6 modulates trabecular and endochondral bone turnover in the nude mouse by stimulating osteoclast differentiation. Bone 26: 469-474 70. Kwan Tat S, Padrines M, Theoleyre S, Heymann D, Fortun Y (2004) IL-6, RANKL, TNF-alpha/IL-1: interrelations in bone resorption pathophysiology. Cytokine Growth Factor Rev 15: 49-60. 71. Romas E, Martin TJ (1997) Cytokines in the pathogenesis of osteoporosis. Osteoporos Int 7 Suppl 3: S47-53. 72. Kimble RB, Vannice JL, Bloedow DC, Thompson RC, Hopfer W, Kung VT, Brownfield C, Pacifici R (1994) Interleukin-1 receptor antagonist decreases bone loss and bone resorption in ovariectomized rats. J Clin Invest 93: 19591967 77 73. Sims NA, Jenkins BJ, Nakamura A, Quinn JM, Li R, Gillespie MT, Ernst M, Robb L, Martin TJ (2005) Interleukin-11 receptor signaling is required for normal bone remodeling. J Bone Miner Res 20: 1093-1102 74. Feng X (2005) Regulatory roles and molecular signaling of TNF family members

in osteoclasts. Gene 350: 1-13 75. Hirayama T, Danks L, Sabokbar A, Athanasou NA (2002) Osteoclast formation and activity in the pathogenesis of osteoporosis in rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford) 41: 1232-1239. 76. Weitzmann MN, Pacifici R (2005) The role of T lymphocytes in bone metabolism. Immunol Rev 208: 154-168 77. Szulc P, Munoz F, Marchand F, Chapuy MC, Delmas PD (2003) Role of vitamin D and parathyroid hormone in the regulation of bone turnover and bone mass in men: the MINOS study. Calcif Tissue Int 73: 520-530 78. Masiukiewicz US, Insogna KL (1998) The role of parathyroid hormone in the pathogenesis, prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis. Aging (Milano) 10: 232-239. 79. Ahmad AM, Hopkins MT, Fraser WD, Ooi CG, Durham BH, Vora JP (2003) Parathyroid hormone secretory pattern, circulating activity, and effect on bone turnover in adult growth hormone deficiency. Bone 32: 170-179 80. Baldock PA, Thomas GP, Hodge JM, Baker SU, Dressel U,

OLoughlin PD, Nicholson GC, Briffa KH, Eisman JA, Gardiner EM (2006) Vitamin D action and regulation of bone remodeling: suppression of osteoclastogenesis by the mature osteoblast. J Bone Miner Res 21: 1618-1626 81. Ikeda K, Ogata E (2000) Modulation of bone remodeling by active vitamin D: its role in the treatment of osteoporosis. Mech Aging Dev 116: 103-111 82. Inzerillo AM, Zaidi M, Huang CL (2002) Calcitonin: the other thyroid hormone. Thyroid 12: 791-798. 83. Pun KK, Chan LW (1989) Analgesic effect of intranasal salmon calcitonin in the treatment of osteoporotic vertebral fractures. Clin Ther 11: 205-209 84. Seeman E (2002) Pathogenesis of bone fragility in women and men. Lancet 359: 1841-1850. 78 85. de Vernejoul MC (1996) Dynamics of bone remodelling: biochemical and pathophysiological basis. Eur J Clin Chem Clin Biochem 34: 729-734 86. Bjarnason NH, Hassager C, Christiansen C (1998) Postmenopausal bone remodelling and hormone replacement. Climacteric 1: 72-79

87. Balasch J (2003) Sex steroids and bone: current perspectives. Hum Reprod Update 9: 207-222. 88. Monson JP, Drake WM, Carroll PV, Weaver JU, Rodriguez-Arnao J, Savage MO (2002) Influence of growth hormone on accretion of bone mass. Horm Res 58 Suppl 1: 52-56. 89. Bassett JH, Williams GR (2003) The molecular actions of thyroid hormone in bone. Trends Endocrinol Metab 14: 356-364 90. Rackoff PJ, Rosen CJ (1998) Pathogenesis and treatment of glucocorticoidinduced osteoporosis. Drugs Aging 12: 477-484 91. Swanson C, Lorentzon M, Conaway HH, Lerner UH (2006) Glucocorticoid regulation of osteoclast differentiation and expression of receptor activator of nuclear factor-kappaB (NF-kappaB) ligand, osteoprotegerin, and receptor activator of NF-kappaB in mouse calvarial bones. Endocrinology 147: 36133622 92. Xiong DH, Shen H, Zhao LJ, Xiao P, Yang TL, Guo Y, Wang W, Guo YF, Liu YJ, Recker RR, Deng HW (2006) Robust and comprehensive analysis of 20 osteoporosis candidate genes by

very high-density single-nucleotide polymorphism screen among 405 white nuclear families identified significant association and gene-gene interaction. J Bone Miner Res 21: 1678 93. Ezura Y, Nakajima T, Urano T, Sudo Y, Kajita M, Yoshida H, Suzuki T, Hosoi T, Inoue S, Shiraki M, Emi M (2007) Association of a single-nucleotide variation (A1330V) in the low-density lipoprotein receptor-related protein 5 gene (LRP5) with bone mineral density in adult Japanese women. Bone 40: 997 94. Lau HH, Ng MY, Cheung WM, Paterson AD, Sham PC, Luk KD, Chan V, Kung AW (2006) Assessment of linkage and association of 13 genetic loci with bone mineral density. J Bone Miner Metab 24: 226 95. Xiong DH, Lei SF, Yang F, Wang L, Peng YM, Wang W, Recker RR, Deng HW (2007) Low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (LRP5) gene 79 polymorphisms are associated with bone mass in both Chinese and whites. J Bone Miner Res 22: 385. 96. Lee YH, Woo JH, Choi SJ, Ji JD, Song GG (2009) Association

between the A1330V polymorphism of the low-density lipoprotein receptor-related protein 5 gene and bone mineral density: a meta-analysis. Rheumatol Int 29: 539-44 97. Tran BN, Nguyen ND, Eisman JA, Nguyen TV (2008) Association between LRP5 polymorphism and bone mineral density: a Bayesian meta-analysis. BMC Med Genet 9: 55. 98. Grundberg E, Lau EM, Lorentzson M, Karlsson M, Holmberg A, Groop L, Mellstrom D, Orwoll E, Mallmin H, Ohlsson C, Ljunggren O, Akesson K (2008) Large-scale association study between two coding LRP5 gene polymorphisms and bone phenotypes and fractures in men. Osteoporos Int 19: 829-837 99. Bustamante M, Nogues X, Enjuanes A, Elosua R, Garcia-Giralt N, Perez-Edo L, Caceres E, Carreras R, Mellibovsky L, Balcells S, Diez-Perez A, Grinberg D (2007) COL1A1, ESR1, VDR and TGFB1 polymorphisms and haplotypes in relation to BMD in Spanish postmenopausal women. Osteoporos Int 18: 235 100. Yang TL, Shen H, Xiong DH, Xiao P, Guo Y, Guo YF, Liu YZ, Recker RR, Deng HW

(2007) Epistatic interactions between genomic regions containing the COL1A1 gene and genes regulating osteoclast differentiation may influence femoral neck bone mineral density. Ann Hum Genet 71: 152-159 101. Mann V, Ralston SH (2003) Meta-analysis of COL1A1 Sp1 polymorphism in relation to bone mineral density and osteoporotic fracture. Bone 32: 711-717 102. Ralston SH, Uitterlinden AG, Brandi ML, Balcells S, Langdahl BL, Lips P, Lorenc R, Obermayer-Pietsch B, Scollen S, Bustamante M, Husted LB, Carey AH, Diez-Perez A, Dunning AM, Falchetti A, Karczmarewicz E, Kruk M, van Leeuwen JP, van Meurs JB, Mangion J, McGuigan FE, Mellibovsky L, del Monte F, Pols HA, Reeve J, Reid DM, Renner W, Rivadeneira F, van Schoor NM, Sherlock RE, Ioannidis JP (2006) Large-scale evidence for the effect of the COLIA1 Sp1 polymorphism on osteoporosis outcomes: the GENOMOS study. PLoS Med 3: e90. 80 103. Lau HH, Ho AY, Luk KD, Kung AW (2004) Transforming growth factor-beta1 gene polymorphisms and

bone turnover, bone mineral density and fracture risk in southern Chinese women. Calcif Tissue Int 74: 516-521 104. Langdahl BL, Carstens M, Stenkjaer L, Eriksen EF (2003) Polymorphisms in the transforming growth factor beta 1 gene and osteoporosis. Bone 32:297-310 105. Medici M, van Meurs JB, Rivadeneira F, Zhao H, Arp PP, Hofman A, Pols HA, Uitterlinden AG (2006) BMP-2 gene polymorphisms and osteoporosis: the Rotterdam Study. J Bone Miner Res 21: 845-854 106. Semprini S, Mango R, Brancati F, Dallapiccola B, Becherini L, Novelli G, De Lorenzo A, Brandi ML, Gennari L (2000) Absence of correlation between BMP4 polymorphism and postmenopausal osteoporosis in Italian women. Calcif Tissue Int 67: 93-94. 107. Fang Y, Rivadeneira F, van Meurs JB, Pols HA, Ioannidis JP, Uitterlinden AG (2006) Vitamin D receptor gene BsmI and TaqI polymorphisms and fracture risk: a meta-analysis. Bone 39: 938-945 108. Thakkinstian A, DEste C, Eisman J, Nguyen T, Attia J (2004) Meta-analysis of

molecular association studies: vitamin D receptor gene polymorphisms and BMD as a case study. J Bone Miner Res 19: 419-428 109. Hsu YH, Niu T, Terwedow HA, Xu X, Feng Y, Li Z, Brain JD, Rosen CJ, Laird N, Xu X (2006) Variation in genes involved in the RANKL/RANK/OPG bone remodeling pathway are associated with bone mineral density at different skeletal sites in men. Hum Genet 118: 568 110. Mencej S, Albagha OM, Prezelj J, Kocjan T, Marc J (2008) Tumour necrosis factor superfamily member 11 gene promoter polymorphisms modulate promoter activity and influence bone mineral density in postmenopausal women with osteoporosis. J Mol Endocrinol 40: 273-279 111. Kim JG, Kim JH, Kim JY, Ku SY, Jee BC, Suh CS, Kim SH, Choi YM (2007) Association between osteoprotegerin (OPG), receptor activator of nuclear factorkappaB (RANK), and RANK ligand (RANKL) gene polymorphisms and circulating OPG, soluble RANKL levels, and bone mineral density in Korean postmenopausal women. Menopause 14: 913-918 81

112. Dvornyk V, Liu XH, Shen H, Lei SF, Zhao LJ, Huang QR, Qin YJ, Jiang DK, Long JR, Zhang YY, Gong G, Recker RR, Deng HW (2003) Differentiation of Caucasians and Chinese at bone mass candidate genes: implication for ethnic difference of bone mass. Ann Hum Genet 67: 216 113. Ioannidis JP, Ralston SH, Bennett ST, Brandi ML, Grinberg D, Karassa FB, Langdahl B, van Meurs JB, Mosekilde L, Scollen S, Albagha OM, Bustamante M, Carey AH, Dunning AM, Enjuanes A, van Leeuwen JP, Mavilia C, Masi L, McGuigan FE, Nogues X, Pols HA, Reid DM, Schuit SC, Sherlock RE, Uitterlinden AG (2004) Differential genetic effects of ESR1 gene polymorphisms on osteoporosis outcomes. Jama 292: 2105-2114 114. L K (1990) Horns, Pronghorns, and Antlers. Evolution, Morphology, Physiology, and Social Significance. George A Bubenik and Anthony B Bubenik, Eds. Springer-Verlag, New York, 1990 xii, 562 pp, illus $89 Science 250: 1458. 115. Goss RJ (1995) Future directions in antler research. Anat Rec

241: 291-302 116. Rucklidge GJ, Milne G, Bos KJ, Farquharson C, Robins SP (1997) Deer antler does not represent a typical endochondral growth system: immunoidentification of collagen type X but little collagen type II in growing antler tissue. Comp Biochem Physiol 118: 303-308. 117. Borsy A, Podani J, Steger V, Balla B, Horvath A, Kosa JP, Gyurjan I, Jr., Molnar A, Szabolcsi Z, Szabo L, Jako E, Zomborszky Z, Nagy J, Semsey S, Vellai T, Lakatos P, Orosz L (2009) Identifying novel genes involved in both deer physiological and human pathological osteoporosis. Mol Genet Genomics 281: 301-313. 118. Balla B, Kosa JP, Kiss J, Borsy A, Podani J, Takacs I, Lazary A, Nagy Z, Bacsi K, Speer G, Orosz L, Lakatos P (2008) Different gene expression patterns in the bone tissue of aging postmenopausal osteoporotic and non-osteoporotic women. Calcif Tissue Int 82: 12-26. 119. Kosa JP, Balla B, Kiss J, Borsy A, Podani J, Takács I, Lazáry Á, Nagy Zs, Bácsi K, Speer G, Orosz L, Lakatos P (2009)

Effect of menopause on gene expression pattern in bone tissue of non-osteoporotic women. Menopause 16: 367-377 82 120. (2002) Incidence of vertebral fracture in europe: results from the European Prospective Osteoporosis Study (EPOS). J Bone Miner Res 17: 716 121. Galibert P, Deramond H, Rosat P, Le Gars D (1987) Preliminary note on the treatment of vertebral angioma by percutaneous acrylic vertebroplasty. NeuroChirurgie 33: 166 122. Phillips FM (2003) Minimally invasive treatments of osteoporotic vertebral compression fractures. Spine 28: S45 123. Lewis G (2007) Percutaneous vertebroplasty and kyphoplasty for the standalone augmentation of osteoporosis-induced vertebral compression fractures: Present status and future directions. J Biomed Mater Res B 81: 371-386 124. Phillips FM, Todd Wetzel F, Lieberman I, Campbell-Hupp M (2002) An in vivo comparison of the potential for extravertebral cement leak after vertebroplasty and kyphoplasty. Spine 27: 2173 125. Padovani B,

Kasriel O, Brunner P, Peretti-Viton P (1999) Pulmonary embolism caused by acrylic cement: a rare complication of percutaneous vertebroplasty. Am J Neuroradiol 20: 375. 126. Ratliff J, Nguyen T, Heiss J (2001) Root and spinal cord compression from methylmethacrylate vertebroplasty. Spine 26: E300 127. Harrington KD (2001) Major neurological complications following percutaneous vertebroplasty with polymethylmethacrylate : a case report. J Bone Joint Surg Am 83-A: 1070. 128. Hulme PA, Krebs J, Ferguson SJ, Berlemann U (2006) Vertebroplasty and kyphoplasty: a systematic review of 69 clinical studies. Spine 31: 1983 129. Mirovsky Y, Anekstein Y, Shalmon E, Blankstein A, Peer A (2006) Intradiscal cement leak following percutaneous vertebroplasty. Spine 31: 1120 130. Ikeuchi M, Yamamoto H, Shibata T, Otani M (2001) Mechanical augmentation of the vertebral body by calcium phosphate cement injection. J Orthop Sci 6: 39 131. Perry A, Mahar A, Massie J, Arrieta N, Garfin S, Kim

C (2005) Biomechanical evaluation of kyphoplasty with calcium sulfate cement in a cadaveric osteoporotic vertebral compression fracture model. Spine J 5: 489 132. Wilke HJ, Mehnert U, Claes LE, Bierschneider MM, Jaksche H, Boszczyk BM (2006) Biomechanical evaluation of vertebroplasty and kyphoplasty with 83 polymethyl methacrylate or calcium phosphate cement under cyclic loading. Spine 31: 2934. 133. Togawa D, Kovacic JJ, Bauer TW, Reinhardt MK, Brodke DS, Lieberman IH (2006) Radiographic and histologic findings of vertebral augmentation using polymethylmethacrylate in the primate spine: percutaneous vertebroplasty versus kyphoplasty. Spine 31: E4 134. Zambonin G, Colucci S, Cantatore F, Grano M (1998) Response of human osteoblasts to polymethylmetacrylate In vitro. Calcif Tissue Int 62: 362 135. Deramond H, Wright NT, Belkoff SM (1999) Temperature elevation caused by bone cement polymerization during vertebroplasty. Bone 25: 17S 136. Chiu R, Ma T, Smith RL, Goodman SB

(2006) Polymethylmethacrylate particles inhibit osteoblastic differentiation of bone marrow osteoprogenitor cells. J Biomed Mater Res A 77: 850-856 137. Chiu R, Ma T, Smith polymethylmethacrylate RL, Goodman particle-induced SB (2007) inhibition of Kinetics of osteoprogenitor differentiation and proliferation. J Orthop Res 25: 450-457 138. Lazary A, Balla B, Kosa JP, Bacsi K, Nagy Z, Takacs I, Varga PP, Speer G, Lakatos P (2007) Effect of gypsum on proliferation and differentiation of MC3T3-E1 mouse osteoblastic cells. Biomaterials 28: 393 139. Lieberman IH, Togawa D, Kayanja MM (2005) Vertebroplasty and kyphoplasty: filler materials. Spine J 5: 305S 140. Giannoudis PV, Dinopoulos H, Tsiridis E (2005) Bone substitutes: an update. Injury 36 Suppl 3: S20-27. 141. Van Heest A, Swiontkowski M (1999) Bone-graft substitutes. Lancet 353 Suppl 1: SI28-29. 142. Sandhu HS, Grewal HS, Parvataneni H (1999) Bone grafting for spinal fusion. Orthop Clin North Am 30:

685-698. 143. Arrington ED, Smith WJ, Chambers HG, Bucknell AL, Davino NA (1996) Complications of iliac crest bone graft harvesting. Clin Orthop Relat Res 329: 300-309 144. Boyce T, Edwards J, Scarborough N (1999) Allograft bone. The influence of processing on safety and performance. Orthop Clin North Am 30: 571-581 84 145. Ehrler DM, Vaccaro AR (2000) The use of allograft bone in lumbar spine surgery. Clin Orthop Relat Res 371: 38-45 146. Tomford WW (1995) Transmission of disease through transplantation of musculoskeletal allografts. J Bone Joint Surg 77: 1742-1754 147. Khan SN, Tomin E, Lane JM (2000) Clinical applications of bone graft substitutes. Orthop Clin North Am 31: 389-398 148. Gazdag AR, Lane JM, Glaser D, Forster RA (1995) Alternatives to Autogenous Bone Graft: Efficacy and Indications. J Am Acad Orthop Surg 3: 1-8 149. Kinnunen I, Aitasalo K, Pollonen M, Varpula M (2000) Reconstruction of orbital floor fractures using bioactive glass. J Craniomaxillofac

Surg 28: 229234 150. Peltola M, Suonpaa J, Aitasalo K, Maattanen H, Andersson O, Yli-Urpo A, Laippala P (2000) Experimental follow-up model for clinical frontal sinus obliteration with bioactive glass (S53P4). Acta Otolaryngol Suppl 543: 167-169 151. Peltier LF (1961) The use of plaster of Paris to fill defects in bone. Clin Orthop 21: 1. 152. Kelly CM, Wilkins RM, Gitelis S, Hartjen C, Watson JT, Kim PT (2001) The use of a surgical grade calcium sulfate as a bone graft substitute: results of a multicenter trial. Clin Orthop Relat Res 382: 42-50 153. Borrelli J, Jr., Prickett WD, Ricci WM (2003) Treatment of nonunions and osseous defects with bone graft and calcium sulfate. Clin Orthop Relat Res 411: 245-254. 154. Chen WJ, Tsai TT, Chen LH, Niu CC, Lai PL, Fu TS, McCarthy K (2005) The fusion rate of calcium sulfate with local autograft bone compared with autologous iliac bone graft for instrumented short-segment spinal fusion. Spine 30: 2293. 155. Bell PA, Chaturvedi S,

Gelfand CA, Huang CY, Kochersperger M, Kopla R, Modica F, Pohl M, Varde S, Zhao R, Zhao X, Boyce-Jacino MT, Yassen A (2002) SNPstream UHT: ultra-high throughput SNP genotyping for pharmacogenomics and drug discovery. Bio Techniques Suppl: 70-72, 74, 7677 85 156. Xie Q, Ratnasinghe LD, Hong H, Perkins R, Tang ZZ, Hu N, Taylor PR, Tong W (2005) Decision forest analysis of 61 single nucleotide polymorphisms in a case-control study of esophageal cancer; a novel method. BMC Bioinformatics 6 Suppl 2: S4. 157. Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ (2005) Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics 21: 263 158. Foroud T, Ichikawa S, Koller D, Lai D, Curry L, Xuei X, Edenberg HJ, Hui S, Peacock M, Econs MJ (2008) Association studies of ALOX5 and bone mineral density in healthy adults. Osteoporos Int 19: 637-643 159. Curtin K, Wong J, Allen-Brady K, Camp NJ (2007) PedGenie: meta genetic association testing in mixed family and case-control

designs. BMC Bioinformatics 8: 448. 160. Gauderman WJ & Morrison JM. QUANTO 11: a computer program for power and sample size calculations for geneticepidemiology studies. http://hydra.uscedu/gxe, 2006 161. Schaid DJ, Rowland CM, Tines DE, Jacobson RM, Poland GA (2002) Score tests for association between traits and haplotypes when linkage phase is ambiguous. Am J Hum Genet 70: 425-434 162. Gonzalez JR, Armengol L, Sole X, Guino E, Mercader JM, Estivill X, Moreno V (2007) SNPassoc: an R package to perform whole genome association studies. Bioinformatics 23: 644. 163. Messeguer X, Escudero R, Farre D, Nunez O, Martinez J, Alba MM (2002) PROMO: detection of known transcription regulatory elements using speciestailored searches. Bioinformatics 18: 333-334 164. Arden NK, Baker J, Hogg C, Baan K, Spector TD (1996) The heritability of bone mineral density, ultrasound of the calcaneus and hip axis length: a study of postmenopausal twins. J Bone Miner Res 11: 530-534 165.

Arden NK, Spector TD (1997) Genetic influences on muscle strength, lean body mass, and bone mineral density: a twin study. J Bone Miner Res 12: 2076-2081 166. Hunter D, De Lange M, Snieder H, MacGregor AJ, Swaminathan R, Thakker RV, Spector TD (2001) Genetic contribution to bone metabolism, calcium 86 excretion, and vitamin D and parathyroid hormone regulation. J Bone Miner Res 16: 371-378. 167. Kaprio J, Rimpela A, Winter T, Viken RJ, Rimpela M, Rose RJ (1995) Common genetic influences on BMI and age at menarche. Human biology; an international record of research 67: 739-753. 168. Snieder H, MacGregor AJ, Spector TD (1998) Genes control the cessation of a womans reproductive life: a twin study of hysterectomy and age at menopause. J Clin Endocrinol Metab 83: 1875-1880. 169. Deng HW, Chen WM, Recker S, Stegman MR, Li JL, Davies KM, Zhou Y, Deng H, Heaney R, Recker RR (2000) Genetic determination of Colles fracture and differential bone mass in women with and without Colles

fracture. J Bone Miner Res 15: 1243-1252. 170. Andrew T, Antioniades L, Scurrah KJ, Macgregor AJ, Spector TD (2005) Risk of wrist fracture in women is heritable and is influenced by genes that are largely independent of those influencing BMD. J Bone Miner Res 20: 67-74 171. Michaelsson K, Melhus H, Ferm H, Ahlbom A, Pedersen NL (2005) Genetic liability to fractures in the elderly. Arch Intern Med 165: 1825-1830 172. Lei SF, Jiang H, Deng FY, Deng HW (2007) Searching for genes underlying susceptibility to osteoporotic fracture: current progress and future prospect. Osteoporos Int 18: 1157-1175. 173. Aguirre JI, Leal ME, Rivera MF, Vanegas SM, Jorgensen M, Wronski TJ (2007) Effects of basic fibroblast growth factor and a prostaglandin E2 receptor subtype 4 agonist on osteoblastogenesis and adipogenesis in aged ovariectomized rats. J Bone Miner Res 22: 877. 174. Kawaguchi H, Katagiri M, Chikazu D (2004) Osteoclastic bone resorption through receptor tyrosine kinase and

extracellular signal-regulated kinase signaling in mature osteoclasts. Mod Rheumatol 14: 1 175. Woei Ng K, Speicher T, Dombrowski C, Helledie T, Haupt LM, Nurcombe V, Cool SM (2007) Osteogenic differentiation of murine embryonic stem cells is mediated by fibroblast growth factor receptors. Stem Cells Dev 16: 305 87 176. Vieira AR, Modesto A, Meira R, Barbosa AR, Lidral AC, Murray JC (2007) Interferon regulatory factor 6 (IRF6) and fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1) contribute to human tooth agenesis. Am J Med Genet A 143: 538-545 177. Coussens AK, van Daal A (2005) Linkage disequilibrium analysis identifies an FGFR1 haplotype-tag SNP associated with normal variation in craniofacial shape. Genomics 85: 563 178. Chmurzynska A (2006) The multigene family of fatty acid-binding proteins (FABPs): function, structure and polymorphism. J Appl Genet 47: 39 179. Shin HD, Kim LH, Park BL, Jung HS, Cho YM, Moon MK, Lee HK, Park KS (2003) Polymorphisms in fatty acid-binding

protein-3 (FABP3) - putative association with type 2 diabetes mellitus. Hum Mutat 22: 180 180. Xu Y, Mirmalek-Sani SH, Yang X, Zhang J, Oreffo RO (2006) The use of small interfering RNAs to inhibit adipocyte differentiation in human preadipocytes and fetal-femur-derived mesenchymal cells. Exp Cell Res 312: 1856-1864 181. Ichikawa S, Koller DL, Johnson ML, Lai D, Xuei X, Edenberg HJ, Klein RF, Orwoll ES, Hui SL, Foroud TM, Peacock M, Econs MJ (2006) Human ALOX12, but not ALOX15, is associated with BMD in white men and women. J Bone Miner Res 21: 556-564. 182. Mullin BH, Spector TD, Curtis CC, Ong GN, Hart DJ, Hakim AJ, Worthy T, Wilson SG (2007) Polymorphisms in ALOX12, but not ALOX15, are significantly associated with BMD in postmenopausal women. Calcif Tissue Int 81: 10-17. 183. Jadhav SB, Jain GK (2006) Statins and osteoporosis: new role for old drugs. The J Pharm Pharmacol 58: 3-18. 184. Nelson-Dooley C, Della-Fera MA, Hamrick M, Baile CA (2005) Novel treatments for

obesity and osteoporosis: targeting apoptotic pathways in adipocytes. Curr Med Chem 12: 2215 185. Nuttall ME, Gimble osteoblastogenesis and JM (2004) adipogenesis Controlling and the the balance consequent between therapeutic implications. Curr Opin Pharmacol 4: 290-294 186. Page-McCaw A, Ewald AJ, Werb Z (2007) Matrix metalloproteinases and the regulation of tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol 8: 221 88 187. Guo LJ, Luo XH, Wu XP, Shan PF, Zhang H, Cao XZ, Xie H, Liao EY (2006) Serum concentrations of MMP-1, MMP-2, and TIMP-1 in Chinese women: agerelated changes, and the relationships with bone biochemical markers, bone mineral density. Clin Chim Acta 371: 137 188. Martignetti JA, Aqeel AA, Sewairi WA, Boumah CE, Kambouris M, Mayouf SA, Sheth KV, Eid WA, Dowling O, Harris J, Glucksman MJ, Bahabri S, Meyer BF, Desnick RJ (2001) Mutation of the matrix metalloproteinase 2 gene (MMP2) causes a multicentric osteolysis and arthritis syndrome. Nat Genet 28:

261. 189. Yamada Y, Ando F, Niino N, Shimokata H (2002) Association of a polymorphism of the matrix metalloproteinase-1 gene with bone mineral density. Matrix Biol 21: 389 190. Yamada Y, Ando F, Niino N, Shimokata H (2004) Association of a polymorphism of the matrix metalloproteinase-9 gene with bone mineral density in Japanese men. Metabolism 53: 135 191. Mendes O, Kim HT, Lungu G, Stoica G (2007) MMP2 role in breast cancer brain metastasis development and its regulation by TIMP2 and ERK1/2. Clin Exp Metastasis 24: 341-351. 192. Wang K, Vishwanath P, Eichler GS, Al-Sebaei MO, Edgar CM, Einhorn TA, Smith TF, Gerstenfeld LC (2006) Analysis of fracture healing by large-scale transcriptional profile identified temporal relationships between metalloproteinase and ADAMTS mRNA expression. Matrix Biol 25: 271 193. Cao J, Venton L, Sakata T, Halloran BP (2003) Expression of RANKL and OPG correlates with age-related bone loss in male C57BL/6 mice. J Bone Miner Res 18: 270. 194.

Taillandier A, Lia-Baldini AS, Mouchard M, Robin B, Muller F, Simon-Bouy B, Serre JL, Bera-Louville A, Bonduelle M, Eckhardt J, Gaillard D, Myhre AG, Kortge-Jung S, Larget-Piet L, Malou E, Sillence D, Temple IK, Viot G, Mornet E (2001) Twelve novel mutations in the tissue-nonspecific alkaline phosphatase gene (ALPL) in patients with various forms of hypophosphatasia. Hum Mutat 18: 83. 89 195. Goseki-Sone M, Sogabe N, Fukushi-Irie M, Mizoi L, Orimo H, Suzuki T, Nakamura H, Orimo H, Hosoi T (2005) Functional analysis of the single nucleotide polymorphism (787T>C) in the tissue-nonspecific alkaline phosphatase gene associated with BMD. J Bone Miner Res 20: 773-782 196. Baroud G, Vant C, Wilcox R (2006) Long-term effects of vertebroplasty: adjacent vertebral fractures. J Long Term Eff Med Implants 16: 265 197. Polikeit A, Nolte LP, Ferguson SJ (2003) The effect of cement augmentation on the load transfer in an osteoporotic functional spinal unit: finite-element analysis.

Spine 28: 991 198. Rohlmann A, Zander T, Bergmann G (2006) Spinal loads after osteoporotic vertebral fractures treated by vertebroplasty or kyphoplasty. Eur Spine J 15: 1255-1264. 199. Kayanja MM, Togawa D, Lieberman IH (2005) Biomechanical changes after the augmentation of experimental osteoporotic vertebral compression fractures in the cadaveric thoracic spine. Spine J 5: 55-63 200. Baroud G, Nemes J, Heini P, Steffen T (2003) Load shift of the intervertebral disc after a vertebroplasty: a finite-element study. Eur Spine J 12: 421-426 201. Chang CY, Teng MM, Wei CJ, Luo CB, Chang FC (2006) Percutaneous vertebroplasty for patients with osteoporosis: a one-year follow-up. Acta Radiol 47: 568. 202. Grohs JG, Matzner M, Trieb K, Krepler P (2005) Minimal invasive stabilization of osteoporotic vertebral fractures: a prospective nonrandomized comparison of vertebroplasty and balloon kyphoplasty. J Spinal Disord Tech 18: 238 203. Trout AT, Kallmes DF (2006) Does vertebroplasty

cause incident vertebral fractures? A review of available data. Am J Neuroradiol 27: 1397 204. Trout AT, Kallmes DF, Kaufmann TJ (2006) New fractures after vertebroplasty: adjacent fractures occur significantly sooner. Am J Neuroradiol 27: 217 205. Murakami H, Yoon ST, Attallah-Wasif ES, Tsai KJ, Fei Q, Hutton WC (2006) The expression of anabolic cytokines in intervertebral discs in age-related degeneration. Spine 31: 1770 206. Omlor GW, Lorenz H, Engelleiter K, Richter W, Carstens C, Kroeber MW, Guehring T (2006) Changes in gene expression and protein distribution at 90 different stages of mechanically induced disc degeneration--an in vivo study on the New Zealand white rabbit. J Orthop Res 24: 385 207. Zhang Y, An HS, Thonar EJ, Chubinskaya S, He TC, Phillips FM (2006) Comparative effects of bone morphogenetic proteins and sox9 overexpression on extracellular matrix metabolism of bovine nucleus pulposus cells. Spine 31: 2173. 208. Anderson DG, Tannoury C (2005)

Molecular pathogenic factors in symptomatic disc degeneration. Spine J 5: 260S 209. Urban JP, Roberts S (2003) Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Res Ther 5: 120. 210. Cs-Szabo G, Ragasa-San Juan D, Turumella V, Masuda K, Thonar EJ, An HS (2002) Changes in mRNA and protein levels of proteoglycans of the anulus fibrosus and nucleus pulposus during intervertebral disc degeneration. Spine 27: 2212. 211. Benneker LM, Heini PF, Anderson SE, Alini M, Ito K (2005) Correlation of radiographic and MRI parameters to morphological and biochemical assessment of intervertebral disc degeneration. Eur Spine J 14: 27 212. Maclean JJ, Lee CR, Alini M, Iatridis JC (2004) Anabolic and catabolic mRNA levels of the intervertebral disc vary with the magnitude and frequency of in vivo dynamic compression. J Orthop Res 22: 1193 213. Antoniou J, Steffen T, Nelson F, Winterbottom N, Hollander AP, Poole RA, Aebi M, Alini M (1996) The human lumbar intervertebral disc: evidence for

changes in the biosynthesis and denaturation of the extracellular matrix with growth, maturation, ageing, and degeneration. J Clin Invest 98: 996 214. Neidlinger-Wilke C, Wurtz K, Urban JP, Borm W, Arand M, Ignatius A, Wilke HJ, Claes LE (2006) Regulation of gene expression in intervertebral disc cells by low and high hydrostatic pressure. Eur Spine J 15 Suppl 3: 372 215. Natarajan RN, Williams JR, Andersson GB (2006) Modeling changes in intervertebral disc mechanics with degeneration. J Bone Joint Surg Am 88 Suppl 2: 36. 91 216. Lin EP, Ekholm S, Hiwatashi A, Westesson PL (2004) Vertebroplasty: cement leakage into the disc increases the risk of new fracture of adjacent vertebral body. Am J Neuroradiol 25: 175 217. Syed MI, Patel NA, Jan S, Harron MS, Morar K, Shaikh A (2005) Intradiskal extravasation with low-volume cement filling in percutaneous vertebroplasty. Am J Neuroradiol 26: 2397. 218. Luo J, Skrzypiec DM, Pollintine P, Adams MA, Annesley-Williams DJ, Dolan P

(2007) Mechanical efficacy of vertebroplasty: Influence of cement type, BMD, fracture severity, and disc degeneration. Bone 40: 1110-1119 219. Boyd AD, Jr., Goldberg VM, Miller LM, Malemud CJ (1984) Effects of polymethylmethacrylate on rabbit articular chondrocytes in monolayer culture. Clin Orthop 189: 279. 220. Silver IA, Murrills RJ, Etherington DJ (1988) Microelectrode studies on the acid microenvironment beneath adherent macrophages and osteoclasts. Exp Cell Res 175: 266. 221. Nakade O, Takahashi K, Takuma T, Aoki T, Kaku T (2001) Effect of extracellular calcium on the gene expression of bone morphogenetic protein-2 and -4 of normal human bone cells. J Bone Miner Metab 19: 13 222. Yamaguchi T, Chattopadhyay N, Kifor O, Butters RR, Jr., Sugimoto T, Brown EM (1998) Mouse osteoblastic cell line (MC3T3-E1) expresses extracellular calcium (Ca2+o)-sensing receptor and its agonists stimulate chemotaxis and proliferation of MC3T3-E1 cells. J Bone Miner Res 13: 1530 223. Yamauchi

M, Yamaguchi T, Kaji H, Sugimoto T, Chihara K (2005) Involvement of calcium-sensing receptor in osteoblastic differentiation of mouse MC3T3-E1 cells. Am J Physiol Endocrinol Metab 288: E608 224. Obrant KJ, Ivaska KK, Gerdhem P, Alatalo SL, Pettersson K, Vaananen HK (2005) Biochemical markers of bone turnover are influenced by recently sustained fracture. Bone 36: 786 225. Veitch SW, Findlay SC, Hamer AJ, Blumsohn A, Eastell R, Ingle BM (2006) Changes in bone mass and bone turnover following tibial shaft fracture. Osteoporos Int 17: 364. 92 226. Sidqui M, Collin P, Vitte C, Forest N (1995) Osteoblast adherence and resorption activity of isolated osteoclasts on calcium sulphate hemihydrate. Biomaterials 16: 1327. 227. Winn SR, Hollinger JO (2000) An osteogenic cell culture system to evaluate the cytocompatibility of Osteoset, a calcium sulfate bone void filler. Biomaterials 21: 2413. 228. Sowa H, Kaji H, Yamaguchi T, Sugimoto T, Chihara K (2002) Smad3 promotes alkaline

phosphatase activity and mineralization of osteoblastic MC3T3-E1 cells. J Bone Miner Res 17: 1190 229. Balooch G, Balooch M, Nalla RK, Schilling S, Filvaroff EH, Marshall GW, Marshall SJ, Ritchie RO, Derynck R, Alliston T (2005) TGF-beta regulates the mechanical properties and composition of bone matrix. Proc Natl Acad Sci USA 102: 18813. 230. Sugama R, Koike T, Imai Y, Nomura-Furuwatari C, Takaoka K (2006) Bone morphogenetic protein activities are enhanced by 3,5-cyclic adenosine monophosphate through suppression of Smad6 expression in osteoprogenitor cells. Bone 38: 206 231. Heiner DE, Meyer MH, Frick SL, Kellam JF, Fiechtl J, Meyer RA, Jr. (2006) Gene expression during fracture healing in rats comparing intramedullary fixation to plate fixation by DNA microarray. J Orthop Trauma 20: 27 232. Rundle CH, Wang H, Yu H, Chadwick RB, Davis EI, Wergedal JE, Lau KH, Mohan S, Ryaby JT, Baylink DJ (2006) Microarray analysis of gene expression during the inflammation and endochondral

bone formation stages of rat femur fracture repair. Bone 38: 521 233. Chiba S, Okada K, Lee K, Segre GV, Neer RM (2001) Molecular analysis of defect healing in rat diaphyseal bone. J Vet Med Sci 63: 603 234. Bucholz RW (2002) Nonallograft osteoconductive bone graft substitutes. Clin Orthop Relat Res 395: 44. 235. Coetzee AS (1980) Regeneration of bone in the presence of calcium sulfate. Arch Otolaryngol 106: 405. 93 236. Tay BK, Patel VV, Bradford DS (1999) Calcium sulfate- and calcium phosphate-based bone substitutes. Mimicry of the mineral phase of bone Orthop Clin North Am 30: 615. 237. Hadjipavlou AG, Simmons JW, Yang J, Nicodemus CL, Esch O, Simmons DJ (2000) Plaster of Paris as an osteoconductive material for interbody vertebral fusion in mature sheep. Spine 25:10 238. Walsh WR, Morberg P, Yu Y, Yang JL, Haggard W, Sheath PC, Svehla M, Bruce WJ (2003) Response of a calcium sulfate bone graft substitute in a confined cancellous defect. Clin Orthop Relat Res 406:

228 94 10. Saját publikációk jegyzéke A disszertáció témájához kapcsolódó publikációk: Lazáry Á, Kósa JP, Tóbiás B, Balla B, Bácsi B, , Nagy Zs, Takács I, Mező T, Speer G, Lakatos P (2008) Single nucleotide polymorphisms in new candidate genes are associated with bone mineral density and fracture risk, Eur J Endocrinol 159: 18796. (IF: 3,239) Lazáry Á, Speer G, Varga PP, Balla B, Bácsi B, Kósa JP, Nagy Zs, Takács I, Lakatos P (2008) The effect of vertebroplasty filler materials on viability and gene expression of human nucleus pulposus cells, J Orthop Res 26: 601-7. (IF: 2,437) Lazáry Á, Balla B, Kósa JP, Bácsi K, Nagy Zs, Takács I, Varga PP, Speer G, Lakatos P (2007) Effect of gypsum on proliferation and differentiation of MC3T3-E1 mouse osteoblastic cells, Biomaterials 28: 393-9. (IF: 6,262) Lazáry Á, Balla B, Bácsi K, Kósa JP, Nagy Zs, Takács I, Speer G, Varga PP, Lakatos P (2007) A szintetikus csontpótló graftok alkalmazásának

összefoglalása. A gipsz szerepe a csontpótlásban: molekuláris biológiai megközelítéssel, saját eredményeink alapján, Orv Hetil 148: 2427-2433. Balla B, Kósa JP, Kiss J, Borsy A, Podani J, Takács I, Lazáry Á, Nagy Zs, Bácsi K, Speer G, Orosz L, Lakatos P (2008) Different Gene Expression Patterns in the Bone Tissue of Aging Postmenopausal Osteoporotic and Non-osteoporotic Women, Calcif Tissue Int 82: 12-26. (IF: 2,435) Kosa JP, Balla B, Kiss J, Borsy A, Podani J, Takács I, Lazáry Á, Nagy Zs, Bácsi K, Speer G, Orosz L, Lakatos P (2009) Effect of menopause on gene expression pattern in bone tissue of non-osteoporotic women, Menopause 16: 367-377. (IF: 3,672) 95 A disszertáció témájához nem kapcsolódó publikációk: Varga PP, Bors IB, Lazary Á (2009) Sacral tumors and Management, Orthop Clin North Am 40: 105-123. (IF: 1,692) Lazary J, Lazary A, Gonda X, Benkő A, Molnár E, Juhász G, Bagdy G (2008): New evidence for the association of the serotonin

transporter gene (SLC6A4) haplotypes, threatening life events and depressive phenotype, Biol Psychiatry 64: 498-504. (IF: 8,456) Bácsi K, Kósa JP, Lazáry A, Balla B, Horváth H, Kis A, Nagy Z, Takács I, Lakatos P, Speer G (2008) LCT 13910 C/T polymorphism, serum calcium, and bone mineral density in postmenopausal women. Osteoporos Int 20: 639-645 (IF: 3,893) Bacsi K, Hitre E, Kosa JP, Horvath H, Lazary A, Lakatos PL, Balla B, Budai B, Lakatos P, Speer G (2008) Effects of the lactase 13910 C/T and calcium-sensor receptor A986S G/T gene polymorphisms on the incidence and recurrence of colorectal cancer in Hungarian population, BMC Cancer 8:317 (IF: 2,71) Bácsi K, Borgulya G, Kósa JP, Lazáry Á, Balla B, Nagy Zs, Takács I, Speer G, Lakatos P (2007) CYP3A7*1 polymorphism, serum dehydroepiandosterone sulphate level and bone mineral density in postmenopausal women, Calcif Tissue Int 80:154159. (IF:2,435) Balla B, Kósa JP, Kiss J, Podani J, Takács I, Lazáry Á, Nagy Zs, Bácsi K,

Speer G, Lakatos P: Transcriptional profiling of immune system-related genes in postmenopausal osteoporotic versus non-osteoporotic human bone tissue. Clin Immunol 131: 354-359 (IF:3,551) Bácsi K, Kósa JP, Lazáry Á, Horváth H, Balla B, Lakatos P, Speer G (2007) A dehidroepiandroszteron és dehidroepiandroszteron szulfát jelentősége a különböző kórállapotokban. Saját eredmények és irodalmi adatok összefoglalása, Orv Hetil 148: 651-7. Bácsi K, Kósa JP, Lazáry Á, Horváth H, Balla B, Lakatos P, Speer G (2007) A CYP3A7*1C-polimorfizmus hatása a csont ásványanyag-tartalmára posztmenopauzás nőkben, Orv Hetil 148: 1273-80. 96 11. Köszönetnyilvánítás A Doktori értekezésemet nem tudtam volna elkészíteni, ha nem dolgozhatok egy olyan csapatban, amely mind szakmailag, mind munkakörülményeket tekintve, mind emberileg a legmagasabb színvonalat képviseli. A munkacsoportunk vezetéséért, a kutatáshoz elengedhetetlen feltételek

megteremtéséért köszönet illeti Prof. Dr Lakatos Pétert, akitől rengeteget tanultam a közös munka során. Szeretném megköszönni témavezetőmnek, Dr. Takács Istvánnak, hogy a PhDképzés és a fokozatszerzés során egyengette utamat, irányította kutatómunkámat és elismerte eredményeimet. Köszönetet szeretnék mondani Dr. Varga Péter Pálnak, az Országos Gerincgyógyászati Központ főigazgatójának, aki bizalmával kezdetek óta kitüntetve, mind tudományos partnerként, mind emberileg nagyon sokban segítette fejlődésemet. Mentoraim közé tartozik Dr. Speer Gábor és Kósa János is, akiknek tudományalapozó tevékenysége és folyamatosan inspiráló személyisége meghatározó volt sikeres kutatómunkámban. PhD hallgató kollegáimmal, Balla Bernadett-tel és Dr. Bácsi Krisztiánnal sikerült olyan csapatot alkotnunk, amiben egymás munkájának támogatása, kiegészítése dominált. Segítségüket köszönöm Köszönettel tartozom a SE I.

Belgyógyászati Klinikájának, és kiemelten a Klinikai Kutató és Izotópdiagnosztikai Laboratórium minden munkatársának, hogy befogadtak, és jó hangulatban, támogató közegben dolgozhattam. Családom mindenben kiállt mellettem a PhD-képzésem alatt, és folyamatos motivációt jelenttettek számomra szüleim és négy testvérem személye. Végül, de kiemelten szeretném megköszönni feleségemnek, Dr. Lazáry Juditnak azt, hogy velem volt és velem van. Nemcsak türelemmel viseltetett irányomban, de az elképzelhető legaktívabb figyelemmel és hévvel vívtuk meg tudományos csatáinkat, amelyek eredményét a közös közlemények is jelzik. 97