Egészségügy | Felsőoktatás » Peptidek és fehérjék szerkezetvizsgálata spektroszkópia és in silico módszerekkel

Peptidek és fehérjék szerkezetvizsgálata spektroszkópia és in silico módszerekkel Eötvös Loránd Tudományegyetem Mik a peptidek és fehérjék? L-konfigurációjú α−aminosavakból felépülő lineáris polimerek 3 betűs kód: -Thr-His-Ile-Ser-Ser-Ile-Met-Pro-Leu-Glu1 betűs kód: T -H -I -S S -I -M -P -L -E Mekkora a méretük? néhány tucat aminosavtól esetleg több ezerig Hogyan alakultak ki az evolúció során a fehérjék? Nem „probálkozhatott” vaktában a természet: •pl. 20 aminosav típus egy 100 hosszú fehérjében •ismétléses variációk száma 20100 ≈ 10130 fehérje típus •egy ilyen fehérje molekulatömege ≈ 12000 Dalton ≈ 10-18g • ha egyetlen példányt csinálunk csupán minden lehetséges kópiából akkor is ≈ 10112 g annak anyagszükséglete az univerzum tömege „csupán” ≈ 2 *1055 g Elsődleges szerkezet: VDCSEYPKPACPKDYRPVCGSDNKTYSNKCNFCNAVVESNGTLTLNHFGKC (turkey ovomucid inhibitor III domain )

Másodlagos szerkezet: hurkok vagy β-kanzarok α-hélix β-redő Harmadlagos szerkezet: a molekula 3D-szerkezete A fehérjék jelentősége Az élő rendszerek legelterjedtebb molekulái a fehérjék, amelyek szinte bármilyen, a sejt számára fontos reakciót el tudnak végezni. Hogyan tud egy mindössze 20 elemből „építkező” polimer ilyen sokrétűvé válni? Mit kódol a primer szekvencia? Mind a polipeptidek, mind a fehérjék α-L-aminosavakból felépülő lineáris polimerek MWLLYLLVPALFCRAGGSIPIPQKLFGEVTSPLFPKPYPNNFETTTVITV PTGYRVKLVFQQFDLEPSEGCFYDYVKISADKKSLGRFCGQLGSPLGNPP GKKEFMSQGNKMLLTFHTDFSNEENGTIMFYKGFLAYYQAVDLDECASRS KSGEEDPQPQCQHLCHNYVGGYFCSCRPGYELQEDRHSCQAECSSELYTE ASGYISSLEYPRSYPPDLRCNYSIRVERGLTLHLKFLEPFDIDDHQQVHC PYDQLQIYANGKNIGEFCGKQRPPDLDTSSNAVDLLFFTDESGDSRGWKL RYTTEIIKCPQPKTLDEFTIIQNLQPQYQFRDYFIATCKQGYQLIEGNQV LHSFTAVCQDDGTWHRAMPRCKIKDCGQPRNLPNGDFRYTTTMGVNTYKA RIQYYCHEPYYKMQTRAGSRESEQGVYTCTAQGIWKNEQKGEKIPRCLPV

CGKPVNPVEQRQRIIGGQKAKMGNFPWQVFTNIHGRGGGALLGDRWILTA AHTLYPKEHEAQSNASLDVFLGHTNVEELMKLGNHPIRRVSVHPDYRQDE SYNFEGDIALLELENSVTLGPNLLPICLPDNDTFYDLGLMGYVSGFGVME EKIAHDLRFVRLPVANPQACENWLRGKNRMDVFSQNMFCAGHPSLKQDAC QGDSGGVFAVRDPNTDRWVATGIVSWGIGCSRGYGFYTKVLNYVDWIKKE MEEED A primer szekvencia ismeretében a kémiai szerkezet, a konstitúció ránézésre megmondható, nem úgy a térszerkezet. A fehérjék térszerkezete moduláris CUB EG CUB CP CP Ser PR Az eukarióta sejteket felépítő ~100 000 fehérje 70% -a több doménből vagy modulból áll. 100 300 500 aminosav Például a Homo sapiens C1r fehérjéje összesen 6 doménből épül fel. A fehérjék moduláris jellege A fehérjék konformációs szempontból autonóm modulokból és az ezeket összekötő polipeptidszakaszokból állnak. MWLLYLLVPALFCRAGGSIPIPQKLFGEVTSPLFPKPYPNNFETTTVITV PTGYRVKLVFQQFDLEPSEGCFYDYVKISADKKSLGRFCGQLGSPLGNPP GKKEFMSQGNKMLLTFHTDFSNEENGTIMFYKGFLAYYQAVDLDECASRS

KSGEEDPQPQCQHLCHNYVGGYFCSCRPGYELQEDRHSCQAECSSELYTE ASGYISSLEYPRSYPPDLRCNYSIRVERGLTLHLKFLEPFDIDDHQQVHC PYDQLQIYANGKNIGEFCGKQRPPDLDTSSNAVDLLFFTDESGDSRGWKL RYTTEIIKCPQPKTLDEFTIIQNLQPQYQFRDYFIATCKQGYQLIEGNQV LHSFTAVCQDDGTWHRAMPRCKIKDCGQPRNLPNGDFRYTTTMGVNTYKA RIQYYCHEPYYKMQTRAGSRESEQGVYTCTAQGIWKNEQKGEKIPRCLPV CGKPVNPVEQRQRIIGGQKAKMGNFPWQVFTNIHGRGGGALLGDRWILTA AHTLYPKEHEAQSNASLDVFLGHTNVEELMKLGNHPIRRVSVHPDYRQDE SYNFEGDIALLELENSVTLGPNLLPICLPDNDTFYDLGLMGYVSGFGVME EKIAHDLRFVRLPVANPQACENWLRGKNRMDVFSQNMFCAGHPSLKQDAC QGDSGGVFAVRDPNTDRWVATGIVSWGIGCSRGYGFYTKVLNYVDWIKKE MEEED Ser PR CUB EG CUB CP CP A moduláris építkezés konzerválódott Bár a fehérjék mérete és funkciója sokszínű, a moduláris felépítésük következetesen megőrzött. EG CUB CUB C1r Koagulációs faktor XII F2 CP EG F1 Ser PR CP EG KR Ser PR CP Szelektin CLECT EG CP Fibronektin F1 CP CP CP CP CP F1 F1 F1 F1 F1 F2 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F1 F1 F1 F2 F3 F3 F3 F3 F3 CP A

moduláris építkezés előnyös Az állatvilág evolúciójának ún „kambriumi robbanását” a moduláris fehérjék megjelenéséhez kötik (sejt-sejt kommunkáció) F1 F1 F1 F1 F1 F1 F2 F2 F1 F1 F1 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 Polipeptidek és fehérjék térszerkezete A ma ismert modulok száma 100 körüli, melyek mérete jellegzetesen 60 és 160 aminosav közé esik. polipeptid 25 50 75 fehérje 100 125 150 aminosav Húzható-e éles határ egy hosszabb polipeptid és egy rövidebb fehérjemodul között? A globuláris térszerkezet A modulok gyakran autonóm rendezetlen feltekeredésű, globuláris és térszerkezetű lineáris polimerek, amelyek rendezett konformációja biológiai funkciójukkal 25 szorosan összefügg. 50 rövidebb 75 100 125 150 aminosav hosszabb Ha e fehérjét denaturáljuk, akkor elveszti nem csak a 3D térszerkezetét, de a biológiai funkcióját is! Az lizozim amiloid szerű

átalakulása Α lizozim egy pontmutációja miatt a konformációsan nyitottabb térszerkezet betöltöttsége megnő és végül amiloid szerű lerakodás figyelhető meg. Booth et al., Nature 385, 787 (1997) Miért szükséges a fehérjetérszerkezet ismerete? Közismert betegségek megértése: •Sarlósejtes anémia (Glu ⇔ Val mutáció ⇒ dezoxihemoglobin fokozott agregációja) •Kergemarha kór (Creutzfeld-Jakob disease) (piron fehérje „misfold”) •szivacsos enkefalopátisz •Alzheimer kór (β-amiloid „misfold” és aggregáció) Racionális gyógyszertervezés: pl. HIV proteáz inhibítor Hány fehérjetérszerkezet ismert ? Milyen erők tartják össze a fehérjéket? Covalent Hydrogen Ionic Van der Waals Hydrophobic forces ~100 kcal/mole ~3 kcal/mole ~ 5 kcal/mole ~1 kcal/mole ~3 kcal/mole electrons shared water-water full charge transfer fluctuating not a bond per se organic-water can attract H-bond induced dipole entropy

driven organic-organic strong in dry crystal at close range only only works in water weak, orientation sensitive weak in water weak weak strong A gyenge kötések (kölcsönhatások) jelentősége a biomolekulák téralkatának kialakítása során igen jelentős i 7B(i-2) 5F (i) 10B (i-3) 8F (i+1) 13B (i-4) 11F (i+2) CO(i-j) CO(i+k) NHi Hátra Előre α-hélix Mik a peptidek és fehérjék? lineáris polimerek amelyek L-konfigucrációjú α−aminosavakból épülnek fel •polaritás (véragygát) •emészthetőség •konformációs mozgékonyság Miért α−aminosavakból ? β-aminosavak : •apolárisabb •proteázokkal szemben ellenállóak •eltérő flexibilitás Seebach et. al Gellman Navas et. al Helv. Him Acta 1996, 79, 913-941 Acc. Chem Res 1998, 31, 173-180 J. Org Chem 1996, 61, 6849-6855 i 7B(i-2) 5F (i) 10B (i-3) 8F (i+1) 13B (i-4) 11F (i+2) CO(i-j) CO(i+k) NHi Hátra Előre 8B (i-2) 6F (i) 12B (i-3) 10F (i+1) 16B (i-4)

14F (i+2) i Möhle et al. Biopol 1999, 50, 167-184 i i (i-4) (i-4) i (i-4) M α-L-aminosavakból felépülő α-hélix térszerkezetek i (i-4) P 13B (i-4) mindkettő „backword” hélix α-hélix 13B (i-4) mínusz vagy plusz bal vagy jobb 6F (i) 8B (i-2) i i i (i-2) β-aminosavakból felépülő hélixek i i (i-3) (i+1) 10F (i+1) 12B (i-3) Homo konformerek periodikus H-hidakkal α- és β-peptidek esetén α-peptidek •5F (i) •8F (i+1) •11F (i+2) •14F (i+3) ⇒β-sheet ⇒? ⇒? ⇒? •7B (i-2) ⇒ γ-turn, invγ-turn •10B (i-3) ⇒310-helix (left, right) •13B (i-4) ⇒ α-helix (left, right) •16B (i-5) ⇒? π-helix β-peptidek •6F (i) •10F (i+1) •14F (i+2) •18F (i+3) ⇒ OK ⇒ OK ⇒ OK ⇒ •8B (i-2) •12B (i-3) •16B (i-4) •20B (i-5) ⇒ OK ⇒ OK ⇒ ⇒ Homo konformerek periodikus H-hidakkal α- és β-peptidek esetén α-peptides γ-turnS γ-turnR invγ-turn β-peptides R invγ-turn S 8B3S 8B3R

enantiomere diasztereomer M8B3R M8B3S A konformácios alapelemek lokalizálása a Ramachandran felületen ∆Ε ψ φ ∆E(kcal*mol–1) ψ φ A 0o ≤ ϕ,ψ ≤360o intervallum esetén a E=E(ϕ, β-redő ψ) α-hélix γ-kanyar α-hélix modell HCO-(L-Ala)n-NH2 n=12 n=10 n=8 n=1 monomer oligomer homo-konformerek alegységeikből történő felépülése (εD)n β-redő α-hélix hetero-konformerek alegységekből történő felépülése Pl. az I-es típusú β-kanyar (βLβLαLδLβLβL) ismétlödő “normál” γ-kanyar [(γD)6] γD balmenetes kollagén hélix ∆E (kcal/mol)εD [(εD)6] balmenetű α-hélix [(αD)6] αD ismétlödő inverz γkanyar [(γL)6] jobbmenetű α-hélix [(αL)6] αL γL βL nyújtott β-redő [(βL)6] Minden királis ? 360 γD δD αL 240 ψ εD εL βDL 120 αD δL 0 0 aD 120 φ γL 240 360 Hogyan lehet a részből az egészre következtetni? φ ψ 360o γD δD αL εD βL εL

ψ Cutinase αD δL γL 0o 0o ϕ 360o bevezető gondolatok 360o γDD δδD αLL D α εDD βLL εεLL ψ ααDD δLL γγLL 0o 0o ϕ 360o Val-Phe-Cys-Asn-Thr-Gly-Asp-Leu-Val-Cys-Thr-Gly-Ser-Leu-Ile-Val-Ala-AlaεL γL δL εL εL γD γL αL αL αL γL αD εL γL εL γL εL αL Pro-His-Leu-Ala-Tyr-Gly-Pro αL αL γL γL γL αL αL Tipikus fehérjeépítő-elem konformációk 360o γD δ D α L εD βL εL ψ α D δ L γL 0o 0o ϕ 360o Tipikus fehérjeépítő-elem konformációk 360o γD δ D α L εD βL εL ψ α D δ L γL 0o 0o ϕ 360o Tipikus fehérjeépítő-elem konformációk 360o γD δ D α L εD βL εL ψ α D δ L γL 0o 0o ϕ 360o Tipikus fehérjeépítő-elem konformációk 360o γD δ D α L εD βL εL ψ α D δ L γL 0o 0o ϕ 360o Tipikus fehérjeépítő-elem konformációk 360o γD δ D α L εD βL εL ψ α D δ L γL 0o 0o ϕ 360o Tipikus fehérjeépítő-elem konformációk 360o

γD δ D α L εD βL εL ψ α D δ L γL 0o 0o ϕ 360o Tipikus fehérjeépítő-elem konformációk 360o γD δ D α L εD βL εL ψ α D δ L γL 0o 0o ϕ 360o Tipikus fehérjeépítő-elem konformációk 360o γD δ D α L εD βL εL ψ α D δ L γL 0o 0o ϕ 360o Tipikus fehérjeépítő-elem konformációk 360o γD δ D α L εD βL εL ψ α D δ L γL 0o 0o ϕ 360o Secondary structure of peptides and proteins: - homo-conformers: α-helix β-pleated sheet collagen helix repeated inverse γ-turn . - hetero-conformers: β-turn Peptidek és fehérjék másodlagos szerkezeti elmei deskripció kód jobbmenetű α-hélix balmenetű α-hélix β- redő inverz γ-kanyar γ-kanyar collagén hélix (polyProII) collagén hélix tükörképi párja αL αD βL γL γD εL εD δL δD alternatív kód αR αL C5 C7eq C7ax β αD β2 α’ A fehérjék feltekeredése A szerkezeti biokémia „dogmája” •Általánosan elfogadott, hogy

az aminosavszekvencia meghatározza a térszerkezetet • Bizonyíték: denaturációs-renaturációs kísérletek (Anfinsen) • A fehérje natív térszerkezete az esetek túlnyomó többségében a globális energiaminimumnak felel meg •Hogyan „találja meg” a fehérje a natív térszerkezetet? • Levinthal-paradoxon: • egy polipeptidlánc lehetséges konformációs állapotainak száma csillagászati (100 aminosav, 9 gerinckonformer/aminosav: 9100 ≈ 2.6 x 1095) • Az ismert fehérjék néhány másodperc (vagy rövidebb idő) alatt feltekerednek: nincs idő a lehetséges téralkatok töredékének kipróbálására sem (világegyetem kora < 1018 s) • A feltekeredés adott útvonalon (útvonalakon) zajlik, lényeges a lokális kölcsönhatások és az azok révén kialakuló szerkezeti „magok” szerepe másodlagos • Alapvető feltekeredési modellek: szerkezeti elemek kialakulása feltekeredett (folded) fehérje „hidrofób összeomlás” kitekeredett

(unfolded) fehérje feltekeredési mag (folding nucleus) A polipeptidlánc számára akár több konformációs állapot is elérhető A ribonukleáz redukciója és denaturálódása Chrisian B. Anfinsen 1972 Nobel-díj Ribonukleáz feltekeredése A ribonukleáz renaturálódása feltekeredés “folding” definíció: 50%-os feltekeredés: amikor a molekulák fele feltekeredett, ám a másik fele kitekeredett marad. memo: nincs félig feltekeredés!!! Kaotróp molekulák LiClO4 4,5 mol 6–8 mol 6 mol Diszulfidhidak elbontása CH3CO3H DTT, ditiotreitol Az Ubiquitin (76 as., 8,5kDa) termodenaturálása: Cp,exp / (mJoC-1) 6 DSC: Differntial Scanning Calorimetry 3 Tm≈55oC Θ/oC 0 30 45 60 75 Az Ubiquitin DSC termogram görbéje alapján a fehérje 45oC alatt megtartja natív téralkatát, aztán endotermikus konformáció változáson megy át. Tm, olvadáspont (olvadási hőmérséklet, melting temperature) az a hőmérséklet ahol egy adott

nyomáson a folyadék és a szilárd fázis egyensúlyban van. Ribonukleáz T1 Tm= 320K. pH=7 és T=298K a fehérje letekeredéshez szükséges ∆G mindössze 22.5 kJmol-1 ami alig több mint egy H-híd (∆G≈20 kJmol-1). Hogy lehet ez, amikor ugyanez a fehérje tele van α-hélixxel és β-redővel, amely egy sor H-hidat tartalmaz? Atkins de Paula 118 Ribonukleáz T1 Tm= 320K. pH=7 és T=298K a fehérje letekeredéshez szükséges ∆G mindössze 22.5 kJmol-1 ami alig több mint egy H-híd (∆G≈20 kJmol-1). Példa: Kérdés: Hogy lehet ez, amikor ugyanez a fehérje tele van α-hélixxel és β-redővel, amely egy sor H-hidat Atkins de Paula 118 tartalmaz? Becsüljük meg a ∆H-t: ~ 4 menet hélix 3.6*4 ~ 15 a.s ~ 12 H-híd ~ 12*2= 24 kcal.mol-1 ~ 3 hosszabb β-redő 3*8 ~ 24 a.s ~ 22 H-híd ~ 22*2 = 44 kcal.mol-1 Σ ∆H > 68 kcal.mol-1 Becsüljük meg a ∆S-t: 1) Legyen a fehérje letekeredett állapotában minden as.-nek 3 lehetséges és egyforma

valószínűséggel megjelenő bb. konformere Ekkor S = R ln (3100) 2) Ha feltekeredik egy 5-ös peptid rész (pl. turn) és annak már csak 1 lehtséges konformere van, akkor S = R ln (395) már csak. (A változás Rln(35) ami szoba hőn (T=25oC) ~ 32 kcalmol-1 3) Ha az egész feltekeredik akkor az S ~ 20* 3.2 = 64 kcalmol-1 ∆G = ∆H-T∆S = 68 -64 = 4 kcal.mol-1 Eszközök és lehetőségek IR- Penetratin 4 3 0% TFE 1 25% TFE 50% TFE 75% TFE 0 -1 -2 NMRRöntgen In silico -3 nanométer 25 1 25 4 25 7 26 0 26 3 26 6 26 9 100% TFE 18 5 18 8 19 1 19 4 19 7 20 0 20 3 20 6 20 9 21 2 21 5 21 8 22 1 22 4 22 7 23 0 23 3 23 6 23 9 24 2 24 5 24 8 CD (UV) delta e psz ilon 2 A módszer okozta “tórzulások” Hogyan ismerhető meg atomi szinten a peptid- és fehérjetérszerkezet? Primer szekvencia kristályosítás ⇓ Röntgen-diffrakció ⇓ elektron sűrűség térkép Oldat készítés ⇓ NMR-spektroszkópia ⇓ geometriai kényszerfeltételek

Szerkezetfinomítás 3D-szerkezet számítógépes modellezés